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973标书-代谢相关蛋白质修饰在肿瘤发生发展过程中的作用及机制

来源:网络 作者:编辑 人气: 发布时间:2016-09-03
摘要:项目名称: 代谢相关蛋白质修饰在肿瘤发生发展过程中的作用及机制 首席科学家: 赵世民 复旦大学 起止年限: 2012.1 至2016.8 依托部门: 教育部 上海市科委 一、关键科学问题及研究内容 关键科学问题 本课题将以代谢相关的蛋白质翻译后修饰为切入点,系统挖
 
 
 
 
项目名称: 代谢相关蛋白质修饰在肿瘤发生发展过程中的作用及机制
首席科学家: 赵世民 复旦大学
起止年限: 2012.1至2016.8
依托部门: 教育部  上海市科委
 

 
一、关键科学问题及研究内容
关键科学问题
 
本课题将以代谢相关的蛋白质翻译后修饰为切入点,系统挖掘参与代谢酶修饰调控的乙酰化和磷酸化等修饰酶及其修饰底物,系统挖掘被代谢物调控的下游被甲基化和羟基化等修饰的蛋白;在此基础上研究其对细胞代谢的作用,作用的分子机理以及在肿瘤发生中的变化规律和生理病理意义;并通过结构生物学方法寻找通过干预修饰进而干预代谢的小分子化合物。具体地,将就如下关键科学问题开展研究:
1. 发展相关技术和研究体系,系统地挖掘代谢相关翻译后修饰的修饰酶及其底物;探索相关蛋白质修饰酶类和底物通过何种网络及分子机制进行调控。
2. 在肿瘤发生、发展过程中,代谢相关翻译后修饰如何变化,以及这些变化对于肿瘤发生发展有何病理意义。
3. 研究能否通过活性小分子化合物干预代谢相关翻译后修饰,进而干预代谢来实现肿瘤的预防与干预。
 
主要研究内容
 
我们将以项目组成员前期在代谢相关的蛋白质翻译后修饰研究为基础,从广度与深度上扩展对代谢失调引发肿瘤机理的研究。在广度方面主要系统地发现参与细胞代谢调控的翻译后修饰的修饰酶,以及被代谢物调控的下游底物蛋白和信号通路。在深度方面主要研究各种翻译后修饰调节代谢的分子机理,重点研究乙酰化修饰参与代谢调控的机制;在代谢物调控下游翻译后修饰和信号通路的分子机理方面,我们将重点研究对组蛋白甲基化和DNA去甲基化酶的调控机理;同时,用结构生物学的策略寻找针对上述具有治疗潜力的靶分子的活性小分子化合物。
 
1. 代谢相关的蛋白质的修饰谱及其在肿瘤发生发展过程中的变化规律 以肝癌和神经胶质瘤等癌症为模型,建立全细胞的与代谢相关的蛋白质乙酰化、磷酸化、羟基化、甲基化修饰鉴定的技术方法与平台。探讨这些肿瘤发病过程中代谢酶的乙酰化、磷酸化修饰的动态变化,以及被代谢中间物调控的下游羟基化、甲基化等蛋白底物与动态变化。
 
2.肿瘤发生发展过程中代谢组的变化规律及其与代谢相关修饰变化的对应关系与调控机制 通过代谢组学、遗传学以及生物化学策略,比较肿瘤细胞与正常细胞中的代谢物组成特点,重点探讨代谢相关修饰改变与代谢组改变的内在联系;建立能反应肿瘤特征的代谢组谱,力争发现肿瘤特异性代谢标志物(群)。
 
3. 肿瘤发生发展过程中一些代谢产物作用的信号通路及对肿瘤发生发展的意义
系统地研究与肿瘤发生密切相关的糖酵解通路与三羧酸循环通路相关代谢中产物在肿瘤发生发展过程中的作用机理。重点研究酮戊二酸(KG)及其结构类似的等代谢中间物影响各种KG依赖的系列双加氧酶功能的分子生化机理及其对细胞信号通路的影响,包括KG对PHD、系列组蛋白去甲基化酶以及DNA去甲基化酶活力的影响以及相关双加氧酶活力被抑制/激活后细胞的生理变化,特别是细胞在表观遗传性状及血管新生等生理性状受双加氧酶活力改变的影响。
 
4. 筛选针对蛋白质修饰酶的活性小分子化合物及其作用机制
针对组学和机理研究所发现的具有重要价值的蛋白质修饰酶类(包括乙酰化酶、去乙酰化酶、双加氧酶、羟基化酶及甲基化酶等), 采用基于结构生物学原理的小分子干预物质的计算、模拟,从天然产物筛选或者人工直接合成出能干预蛋白质修饰酶类活性的小分子化合物, 通过对发现的活性小分子化合物进行生化、生理功能进行验证,然后根据结晶学手段解析蛋白修饰酶与小分子化合物形成复合体的三维晶体结构,根据小分子化合物与蛋白修饰酶结合的关键结构元素特点,对可能成药的小分子进行优化及药理效应研究。
 

 
二、预期目标
总体目标
 
从代谢相关蛋白质修饰的发生、调节和动态相互作用机制及其生理病理意义这一核心科学问题出发,构建高通量蛋白组学方法、系统地挖掘与代谢密切相关的蛋白质乙酰、磷酸化、羟基化及甲基化修饰酶类及其靶蛋白的蛋白质组学、系统生物学和生物信息学内涵;用遗传和生物化学方法鉴定一批新的蛋白质乙酰化修饰酶类, 用代谢组学方法比较乙酰化修饰酶类在生理及病理条件下蛋白组水平的变化及因此引起的代谢酶乙酰化修饰变化和细胞代谢组变化;建立全细胞水平的蛋白质羟基化修饰靶蛋白数据库 并确定一些关键羟基化蛋白质的动态调控机制, 并研究它们的信号调控网络;以机理研究为根据,通过结构生物学方法系统研究蛋白修饰酶HAT、SIRT和双加氧酶的结构,以及修饰酶与代谢中间物和修饰酶底物组成的复合体的分子结构,利用结构信息,结合生物化学,生物物理学及细胞生物学的方法,通过改变相关蛋白质以及它的整个复合体在此的作用位点的结构来验证其生物学功能,为治疗修饰酶相关疾病提供小分子药物设计和优化的结构模板,为修饰酶相关的癌症等疾病的治疗提供新的途径, 确定并优化可以调节代谢酶乙酰化活性的小分子药物先导化合物。 通过本课题的实施使我国在代谢与肿瘤发生研究的相关领域保持来之不易的国际领先地位;力争使我国在该方向的转化医学研究和开发具有自主知识产权的抗癌新药重大需求方面有所突破。最后,以本项目的实施为契机, 促进国内蛋白质组学、代谢组学、生物化与分子生物学、 结构生物学以及生物信息学的衔接和交叉集成, 使参与课题的年轻骨干成员成为国内相关研究的领军人才,使参与单位成为国内开展代谢与肿瘤研究的基地,同时培养一批交叉学科人才。
 
五年目标
       
      1. 初步建立乙酰化调控代谢酶的网络系统
 
系统鉴定参与各个代谢酶乙酰化的修饰酶,主要研究糖酵解通路和三羧酸循环通路中各个代谢酶的乙酰化修饰酶。阐明乙酰化酶和去乙酰化酶对于各个代谢酶生化性质的调控机理。阐明乙酰化酶和去乙酰化酶对于各个代谢中间物的调控后果。明确乙酰化修饰与已知磷酸化等修饰之间对代谢调控的相互关系。
       
      2. 明确翻译后修饰对代谢物的调控系统
 
系统研究代谢酶翻译后修饰改变对细胞代谢物的调控作用。用代谢组学方法研究单个及多个代谢酶翻译后修饰改变对细胞代谢物及代谢流(metabolic flux)的影响,重点研究如何通过调节代谢酶的乙酰化水平调节糖酵解通路与三羧酸循环通路的相对代谢流。寻找抑制Warburg effect进而抑制肿瘤生长的方法。
       
      3. 建立代谢物影响表观遗传及信号通路的调控网络
 
明确细胞内KG及其结构类似代谢物浓度对于组蛋白甲基化水平和DNA甲基化水平的调控机理。重点明确包括延胡索酸(fumarate)、琥珀酸(Succinate)、苹果酸(malate)以及2-hydroxylglutarate等KG结构类似代谢物对于组蛋白甲基化水平和DNA甲基化水平的调控机理。阐明5-10个因组蛋白甲基化水平或DNA甲基化水平改变导致的下游基因表达改变及其病理生理效应。系统寻找细胞内活性受KG及其结构类似代谢物浓度调控的脯铵酸羟基化酶。建立蛋白质羟基化的蛋白组学分析方法,用蛋白修饰组学方法鉴定全细胞水平羟基化修饰的蛋白质底物。阐明5-10个羟基化修饰的底物蛋白在酮戊二酸及其结构类似代谢物浓度改变时导致的信号通路改变及生理病理效应。
       
      4. 解析3-5个代谢相关蛋白修饰调控酶的晶体结构,设计并优化5-10个可以调节代谢或抑制代谢相关肿瘤发生信号通路的药物先导小分子化合物
 
根据乙酰化修饰调控酶对于调控代谢酶活力及代谢中间物的重要性以及根据双
加氧酶对于调控下游基因的重要性,有选择性的解析3-5个代谢酶相关的乙酰化修饰酶的晶体结构。基于具有生理或临床意义的候选的修饰酶,结合修饰酶的结构特点,发现或合成能干预其活性的小分子化合物,就其药理效应开展在细胞甚至整体水平的深入研究并优化其结构与功效。争取对每一种候选的修饰酶发现 3 种以上的先导小分子化合物。
       
      5. 取得具有国际影响的原创性成果并力争实现转化突破
 
在国际重要学术刊物上发表高水平论文 50 篇以上。其中,在影响因子大于 10 的刊物发表 10 篇以上,在代谢与肿瘤研究取得国际领先地位。申请8-15项与本项目成果直接相关的发明专利,并有1-2项实现初步转化。
       
      6. 培养一批国内从事代谢调控及蛋白质修饰研究的交叉学科人才,使其中部分人才具有一定国际知名度。
 
 

 
三、研究方案
本项目将以已知的与代谢密切相关的肝癌、胃肠肿瘤以及神经胶质瘤等癌症为模型,开展研究。
 
学术思路
 
围绕代谢相关蛋白质翻译后修饰调控肿瘤发生这个核心主题,我们将聚焦代谢调控机制与代谢物和代谢下游信号通路这三个关键因素,解析如下主要科学问题:1,肿瘤细胞中与代谢相关的蛋白质翻译后修饰的作用与调控机制;2,肿瘤过程中与蛋白质修饰调控相关的代谢中间物产生的特点与机制; 3,肿瘤过程中与蛋白质修饰调控相关的代谢中间物对肿瘤相关信号通路的影响。并在此基础上,明确与代谢调控的及与代谢中间物相关的下游蛋白质靶标,进而通过结构生物学的方法寻找可以调控这些靶标蛋白的药物先导化合物。
 
技术途径
 
一、采用方法学研究与应用研究并重的研究策略,研究代谢相关的蛋白质翻译后修饰。 针对课题组成员已经发展了蛋白质磷酸化、甲基化、乙酰化等检测技术,以及对于蛋白质组羟基化修饰的分析还缺乏成熟手段的现状,在本课题中我们采用方法学研究与应用研究并重的研究策略。具体技术途径包括: 1. 利用固相标记定量技术进行蛋白组学分析。
溶液标记是广泛使用的标准标记方法,该策略需要许多人为操作步骤,如样品除盐,添加标记试剂,孵化反应,终止反应,样品混合,除盐等,这些都会影响样品的回收率和分析的重复性,而且费时费力,容易出错。我们将使用我们发展的基于两相柱的固相标记定量多维分析的平台开展相关蛋白组学研究。平台将固相标记与多维分析结合,有利于定量的自动化实现蛋白质组的通量化分析,可以在30个小时(包括标记时间)定量分析1000多个蛋白质。 2. 利用抗体亲和富集技术开展蛋白质组乙酰化组分析。 蛋白质组乙酰化分析的关键是如何有效富集乙酰化肽段。我们制备的抗体可以高特异性的将乙酰化肽段富集出来。蛋白质组样品经过分级后,每个组分分别用蛋白质酶切。然后利用抗体将赖氨酸残基乙酰化的肽段富集出来,接着利用液相色谱质谱连用分析富集的肽段,最后利用数据库检索和数据处理实现乙酰化蛋白质与其修饰位点的鉴定。利用该方法分析蛋白质组乙酰化,可以鉴定上千个赖氨酸乙酰化蛋白质。 3. 采用固定亲和技术进行蛋白质组磷酸化分析。 蛋白质组磷酸化的分析需要包括磷酸化肽段提取技术、磷酸肽的鉴定技术等多种技术的整合。我们发展了一种具有自主知识产权的基于钛离子的固定亲和色谱(Ti(IV)-IMAC)的磷酸肽富集技术,比常规富集技术能鉴定更多的磷酸肽;在磷酸肽鉴定的数据处理方面,发展了一种结合二级和三谱高可信鉴定磷酸肽的方法,开发了一个磷酸化蛋白质组分析专用的软件。为了能够规模化分析,还需要对复杂组学样品进行有效分级。我们因此发展了一种具有高正交性质的反相色谱(RPRP-LC)技术用于磷酸肽的多维分离。将Ti(IV)-IMAC富集技术、RPRP-LC多维分离技术和磷酸肽鉴定的数据处理技术与平台结合起来,可以组成一个具有鉴定上万个磷酸化位点的蛋白质组磷酸化规模化分析的平台。 4.完善并采用重甲基SILAC技术进行蛋白质组的甲基化分析。
蛋白质甲基化主要修饰精氨酸、赖氨酸残基,但也修饰谷氨酸、组氨酸、天冬氨酸等其它残基。由于在多个残基上都可以被修饰、有的残基如赖氨酸还能被多达三个甲基修饰,所以在蛋白质组学分析中鉴定甲基化肽段,需要在数据库检索中设臵很多可变修饰,这使检索空间急剧扩大,导致甲基化修饰的肽段很难被可信的鉴定出来。在Mann等人发展了一种重甲基SILAC技术中,细胞代谢使[13CD3] 蛋氨酸转化为细胞唯一的甲基供体[13CD3]SAM(S-腺苷甲硫氨酸),从而使标记的样品中的所有甲基化肽段与没有标记的样品中的甲基化肽段有了一定的质量差别。当标记的样品与不标记的样品混合时,在质谱中成对出现的峰就是甲基化的肽段,从而将其与大量的非修饰肽区分出来。Mann等人利用这种技术鉴定了59个精氨酸甲基化位点。最近我们改进了这一方法,直接利用合成的[13CD3]SAM进行代谢标记,可以使鉴定的甲基化蛋白质超过100个。
 
二、采用遗传与代谢组的方法系统研究与代谢相关的蛋白质的修饰的调控网络及其对代谢组的作用。 1. 采用自上而下式的思路研究蛋白乙酰化过程失调对相关蛋白功能、代谢调控通路、代谢产物及整体生化网络的系统影响。利用建立的代谢组测定方法(GC-Tof/MS,NMR),测定正常及肿瘤细胞胞质中的代谢物组成,研究肿瘤细胞代谢特征及寻找肿瘤相关特异代谢物谱;正常及肿瘤细胞中比较过表达去乙酰化酶基因、去乙酰化酶抑制剂SAHA干预条件下的特征性代谢通路/网络变化;比较肿瘤细胞及正常细胞对乙酰化调控的反应;研究蛋白乙酰化异常导致代谢变化与肿瘤细胞生长间的关联;通过对不同剂量SAHA干预条件下细胞代谢谱动态分析,描述蛋白乙酰化对代谢过程影响的动态特征;在分子水平发现能刻画肿瘤特征的代谢模式、特征(修饰)蛋白表达谱以及代谢标志物(群),初步阐述若干个关键环节的分子机制以及调控网络(研究流程见附图2)。 2. 通过构建过表达去乙酰化酶基因的正常及肿瘤细胞模型,并结合施以去乙酰化酶抑制剂处理;采用LC/LC-MS/MS和双向电泳蛋白质组技术系统分析胞质蛋白质及乙酰化蛋白质表达情况,同时用国际上两大代谢组学流派所采用的核磁共振技术和色质联用技术分析胞质代谢物谱;创新性地建立“Printing Assay”分析方法,对同一状态下生命体的蛋白质组、乙酰化蛋白质组及代谢组数据,利用计算生物学方法进行计算整合,结合KEGG等代谢途径的网络数据库,筛选与肿瘤发生发展密切相关的关键蛋白质和代谢调控网络,一体化地分析蛋白乙酰化修饰对细胞代谢的调控作用;发现与揭示肿瘤发病过程中小分子代谢物与蛋白质间的相互关系,阐明过度激活或抑制的代谢途径在代谢网络异常改变中的作用及其生物学效应,为代谢分子功能异常导致蛋白修饰、调控失常的疾病研究提供新思路;在对干预肿瘤细胞蛋白乙酰化过程的代谢组与蛋白质组分析的基础上,构建关键代谢物失调的细胞模型,利用分子生物学方法研究肿瘤相关异常代谢途径中所涉及的蛋白质水平或活性的改变;在基于对肿瘤异常代谢途径认识的基础上,寻找各种生理、病理状态下的关键调控通路和网络变化以及引起这些变化的分子作用机制;通过对细胞模型的药物干预,发现和验证功能蛋白质分子,以及发现潜在的疾病治疗靶点。
作为代谢组学和蛋白质组学的一个重要技术组成–计算生物学数据分析和整合中扮演着举足轻重的角色,尤其是基于不同水平(蛋白质组–乙酰化蛋白质组–代谢组)、不同处理(对照–去乙酰化–乙酰化)的数据整合。因此,本方向还将同时采用比较研究策略分析正常及肿瘤细胞的乙酰化蛋白表达特征和代谢物谱及代谢通路特征;通过综合使用各类高通量信息提取和多元化分析技术,分析生化网络在常态和病态下的结构组成和动态变化。如何建立和完善适用的计算生物学方法,从海量的生物化学数据中提取有用的与肿瘤相关的信息并在蛋白质与代谢物水平进行整合是本部分重要研究内容之一。 3. 蛋白质乙酰化修饰的上游调控酶SIRT及乙酰化酶功能及调控的上下游机制及其在代谢物调控中的作用及生理意义。主要研究:(1)在肝癌HepG2细胞中,研究SIRT1和p300调控的乙酰化修饰水平是否影响肝癌细胞脂肪酸合成和细胞增殖,以及ChREBP的表达和转录活性是否在其中发挥重要作用;(2)比较ChREBP敲除鼠(已有)和野生型小鼠在化学致癌剂(二乙基亚硝胺,DEN)和高脂饮食条件下肝癌发生的异同,并进一步研究肝脏不同乙酰化水平对于以上小鼠模型中肝癌发生的影响;(3)比较100例左右肝癌病人的肝癌组织及其正常肝组织的Sirt1,p300和ChREBP的mRNA和蛋白水平以及ChREBP的乙酰化水平,寻找其中变化规律及其与肝癌细胞增殖和病人各项生理指标的关系。
 
三、利用分子细胞生物学、生物化学方法,我们将主要研究代谢酶的乙酰化与磷酸化等翻译后修饰调控代谢的分子机制,以及代谢中间物通过影响下游蛋白质翻译后修饰调节细胞信号通路的分子机制。
      1. 通过培养的细胞系研究乙酰化、磷酸化等翻译后修饰对代谢酶的调节作用。选用代谢相关组织的细胞系HEK293(肾细胞)、HepG2(肝细胞)和U87MG(神经胶质瘤细胞)等作为实验材料开展培养细胞的各项试验;采用第一、第二类去乙酰化酶(HDACs)抑制剂TSA(5g/ml)与第三类去乙酰化酶(SirTs)抑制剂Nicotinamide(5-10mM)同时处理细胞或病理样品以获得不同乙酰化水平的蛋白质,研究乙酰化对代谢酶生化性质的影响;用NaF或Vanadate抑制磷酸酶活力,研究磷酸化对蛋白功能的调控;采用western blotting方法检测蛋白质的乙酰化、磷酸化、甲基化或羟基化,采用自制或商业购买的抗乙酰化赖氨酸探测,用GE公司的ECL plus显色,GE公司的Typhoon Trio扫描仪检测;采用siRNA或shRNA方法对需要敲落的相关基因进行敲落,采用knock in,overexpress等方法在细胞中表达需要的基因。采用Tandem Affinity Purification (TAP)及免疫共沉淀技术鉴定及确认参与代谢酶乙酰化的修饰酶;各个代谢酶、代谢酶修饰酶(乙酰化酶及去乙酰化酶)以及各种双加氧酶(PHD、组蛋白去甲基化酶、DNA去甲基化酶)的酶活的测定将按照文献方法进行。
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