欢迎来访Www.Ggene.Cn,基因时代为生命科学提供源动力!

网站地图帮助中心

二级
导航

RNAi的实验原理及其设计方法

来源:未知 作者:编辑 人气: 发布时间:2016-10-08
摘要:几十年来生物学上最重要的进展,也许是关于RNA分子能调节基因表达的发现。RNA干涉(RNAi)是指双链RNA分子使基因表达沉寂的现象,是在线虫中发现的,在 1998年的一篇Nature论文中被公诸于众。 此后,科学家们明白,RNAi还有其他形式,它既是一种了解基因功能的

几十年来生物学上最重要的进展,也许是关于RNA分子能调节基因表达的发现。RNA干涉(RNAi)是指双链RNA分子使基因表达沉寂的现象,是在线虫中发现的,在 1998年的一篇Nature论文中被公诸于众。

此后,科学家们明白,RNAi还有其他形式,它既是一种了解基因功能的强大工具,又是很多生物的基因组所采用的一种在演化上来讲很古老的防卫方法。RNAi肯定有很多新用途,RNAi还可能具有一些仍然有待去发现的天然功能。

RNAi实验原理与方法

近年来的研究表明,将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞,可以使mRNA发生特异性的降解,导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰(RNAi)。

一、RNAi的分子机制

通过生化和遗传学研究表明,RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段,加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, sirnas)。证据表明;一个称为Dicer的酶,是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员,它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方式引入的双链RNA,切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs),每个片段的3’端都有2个碱基突出。

在RNAi效应阶段,siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mrna转录本上,并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了,但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。

另外,还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.

二、如何进行RNAi试验

(一)siRNA的设计

1. 在设计RNAi实验时,可以先在以下网站进行目标序列的筛选:

http://www.genesil.com/business/products/order2.htm

http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html

http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html

http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710

2.RNAi目标序列的选取原则:

(1)从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始,寻找“AA”二连序列,并记下其3'端的19个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%―55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。

Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区(untranslated regions,UTRs),原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库(人,或者小鼠,大鼠等等)进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。

例如使用BLAST( www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)

(3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA,以找到最有效的siRNA序列。

3.阴性对照

一个完整的siRNA实验应该有阴性对照,作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成,但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱,同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。

4.目前已证实的siRNA可以在下面的网页找到:

http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49

http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.html

http://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html

http://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published

(二)siRNA的制备

目前为止较为常用的方法有通过化学合成,体外转录,长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)体外制备siRNA,以及通过siRNA表达载体或者病毒载体,PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。

体外制备

1.化学合成

许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高,定制周期长,特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高,为一个基因合成3―4对siRNAs 的成本就更高了,比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。

最适用于:已经找到最有效的siRNA的情况下,需要大量siRNA进行研究

不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是价格因素

2.体外转录

以DNA Oligo为模版,通过体外转录合成siRNAs,成本相对化学合成法而言比较低,而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比,还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小,稳定性好,效率高,只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果,从而使转染效率更高。

最适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。

不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA。长期研究。

3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA

其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法――制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200―1000碱基的靶mRNA模版,用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ,然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化,得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后,这个siRNA混合物就可以直接转染细胞,方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs,通常能够保证目的基因被有效地抑制。

dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤,为研究人员节省时间和金钱(注意:通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜)。不过这种方法的缺点也很明显,就是有可能引发非特异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。

最适用于:快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型

不适用于:长时间的研究项目,或者是需要一个特定的siRNA进行研究,特别是基因治疗

体内表达

前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs,并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于:从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。

4. siRNA表达载体

多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆,这个过程需要几周甚至数月的时间,同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。

siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究――带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。

病毒载体也可用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。

作者:编辑

Copyright 2008-2015 Powered By Ggene.Cn.
鄂ICP备15005758号-1

声明:本网站尊重并保护知识产权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果我们转载或引用的作品侵犯了您的权利,请通知我们,我们会及时删除!