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哺乳动物组织样品RNA的抽提(图片详解)

来源:未知 作者:admin 人气: 发布时间:2009-05-29
摘要:哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解,以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。 一、实验材料: Trizol试剂(Invitrogen公司) 研钵,匀浆器,镊子,铝箔都高温灭菌即可; 二、

哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解,以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。

一、实验材料:

Trizol试剂(Invitrogen公司)

研钵,匀浆器,镊子,铝箔都高温灭菌即可;

二、具体过程:

1、样品在离体后应迅速冷冻在液氮中,若是比较大块的组织,要尽量把组织剪切成黄豆大小的块,使液氮迅速渗透到组织内部而防止组织内部的RNA降解。组织用铝箔包好或放入冻存管中,并做好记号,注意不要把记号写在纸上,以防纸被组织的血水渗透而导致记号模糊。可以把铝箔放入纱布袋并储存在液氮中。

2、在抽提RNA前,先把研钵预冷,往研钵内反复加入液氮,至少4-5次,使研钵充分预冷。从液氮罐中取出样本后,把组织块放入已预冷的研钵中进行研磨,边研磨边加液氮(图1),整个过程都不要使液氮挥干。一次研磨的组织块重量不要超过300mg。


图1 用研钵在液氮中把样品研成粉末

3、研磨到组织样品成粉末状后(一般需要8-10min的研磨过程),在液氮基本挥发完时,在每个研钵中加2-3ml Trizol试剂。由于此时研钵很冷,Trizol加入后会冻结成固体状(图2)。可以继续研磨此固体成粉末(图3),随着研钵温度回升到室温,固体状的Trizol逐步回复到液体状态(图4),此时,若发现液体很粘,研杵能牵起丝状物,说明Trizol的量太少,需在此步继续补加Trizol。若Trizol的量过少,会导致抽提的RNA中有较多的基因组DNA污染。由于Trizol试剂中含有强烈的RNA酶抑制剂,因此组织样品和Trizol充分研磨混匀后就不用担心RNA的降解了。


  图2 在冰冷的研钵中加入Trizol试剂后            图3 继续把成固体状的Trizol进行研磨
,Trizol试剂会冻结成固体          


图4 随着研钵的温度回复到室温,Trizol试剂逐步又变为液体

4、把此Trizol试剂转移到玻璃匀浆器中,再进一步匀浆3-5min(图5)。


图5 Trizol试剂转移到玻璃匀浆器中,再进一步匀浆

5、再把Trizol试剂转移到1.5ml离心管中(图6),后续可以按照Trizol试剂的标准操作抽提总RNA。也可以把此Trizol试剂保存在生物冰(低于15℃即可)邮寄给我们,由我们来完成后续的抽提过程。


图6 把Trizol试剂转移到1.5ml的离心管中

说明:

1、研磨,匀浆过程中使用过的器具放入八四消毒液中浸泡消毒一天后,再用洗涤灵洗刷干净晾干后泡酸过夜,洗刷晾干后包上铝箔高压灭菌后,180℃烘烤4小时以备下次使用。

2、此方法看上去过程虽然比较繁琐,但得到的RNA质量好,抽提的RNA量比其他方法要高,比如米粒大的胃镜标本平均能提出约10 g总RNA,足够做一张人22K全基因组芯片了。得到的RNA的电泳检测图片如图7。 3、另外在我们的工作中,接触到一些用户在取了组织后,马上冻到-70℃冰箱来保存,然后提取RNA做反转录,这样的样品中RNA往往有较大的降解,用来做一些基因的RT-PCR还可以,但若做芯片工作就不行了。要尽量先液氮速冻。


图7 用以上方法抽提胃镜标本的RNA甲醛变性胶电泳图

作者:admin

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