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基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒

来源:未知 作者:无城 人气: 发布时间:2009-09-08
摘要:一、目的 对采集的可疑病例标本进行检测,筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。 二、引物 NIC引物 引物名称 碱基组成 目的片段大小 备注 FluA FluA-M-F30 TTCTAACCGAGGTCGAAACG 235bp 甲型流感病毒M基因通用检测引物 FluA-M-R264 ACAAAGCGTCTACGC

基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒

 

一、目的
 

 

  对采集的可疑病例标本进行检测,筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。
 

 

  二、引物
 

 

  

NIC引物
 
  
引物名称
 
  
碱基组成
 
  
目的片段大小
 
  
备注
 
  
FluA
 
  
FluA-M-F30
 
  
TTCTAACCGAGGTCGAAACG
 
  
235bp
 
  
甲型流感病毒M基因通用检测引物
 
  
FluA-M-R264
 
  
ACAAAGCGTCTACGCTGCAG
 
  
H1HA
 
  
H1 F1147
 
  
AAGAGCACACATAATGCCAT
 
  
527bp
 
  
H1N1亚型检测通用引物
 
  
H1 R1673
 
  
CCATTRGARCACATCCAG
 
  
HuH1HA
 
  
H1HA F768
 
  
ACTACTGGACTCTGCTGGAAC
 
  
327bp
 
  
人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物
 
  
H1HA R1094
 
  
CAATGAAACCGGCAATGGCTCC
 
  
SWH1HA-1
 
  
SW-H1 F786
 
  
AATAACATTAGAAGCAACTGG
 
  
153bp
 
  
此次甲型H1N1亚型流感病毒引物
 
  
SW-H1 R920
 
  
AGGCTGGTGTTTATRGCACC
 
  
RnaseP
 
  
RnaseP F
 
  
AGA TTT GGA CCT GCG AGC G
 
  
约80bp
 
  
与real-time PCR中RnaseP引物一致
 
  
RnaseP R
 
  
GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT
 
  

 

 

  三、材料及仪器
 

 

  1、 RNA 提取试剂盒QIAGen RNeasy Mini Kit (catalog #74104)
 

 

  2、β-巯基乙醇(SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115)
 

 

  3、70%乙醇
 

 

  4、RT-PCR Kit:QIAGEN One step RT-PCR Kit(catalog #210212)
 

 

  5、RNasin Ribonuclease Inhibitor (Promega catalog #N2111)
 

 

  6、检测引物
 

 

  7、Axygen 1.5mL离心管,货号:MCT-150-C
 

 

  8、Axygen 0.2mL PCR管,货号:PCR-02-C
 

 

  9、Axygen 10μL,100μL,200μL,1000μL带滤芯枪头
 

 

  10、10μL,100μL,200μL,1000μL加样器
 

 

  11、可调转速14K离心机:
 

 

  12、旋涡混合器:
 

 

  13、生物安全柜:二级生物安全柜
 

 

  14、PCR仪:
 

 

  15、琼脂糖:Biowest Agarose Distributed by Gene Tech(Shanghai)Company Limited Lot No. 101685
 

 

  16、核酸染料:
 

 

  17、电泳液:5×TBE电泳缓冲液 cat No. 9009032718.电泳槽、电泳仪
 

 

  四、实验步骤
 

 

  (一)RNA提取
 

 

  1、根据标本数量分装RLT液:从Kit中取出RLT液,用1.5mL离心管分装,每管500μL(在体系配制区操作)。
 

 

  2、在生物安全柜内将采样液(鼻拭子、咽拭子、胸水等)或病毒培养物(鸡胚尿囊液或细胞培养液)取100μL加入RLT液管中,充分混匀。
 

 

  3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇,混匀后依次加入600μL 70%的乙醇,充分混匀。
 

 

  4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管,打开包装将其做好标记。取步骤(3)中的混合液600μL加入滤柱中,12000rpm,离心15s,弃收集管中的离心液。
 

 

  5、滤柱仍放回收集管上,将步骤(3)剩余的混合液全部吸入滤柱中,12000rpm,离心15s,弃离心液。
 

 

  6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液,12000rpm,离心15s。
 

 

  7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管,将离心后的滤柱移到新的收集管上,于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液,12000rpm,离心15s。
 

 

  8、弃收集管中的离心液,再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液,13000~14000rpm,离心2min。
 

 

  9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上,向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water,室温静置1~3min。
 

 

  10、12000rpm,离心1min,收集离心液即为提取的病毒RNA,立即做实验或-20℃以下保存。
 

 

  注意:Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。
 

 

  (二)反应体系配制
 

 
作者:无城

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