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琼脂糖凝胶电泳

来源:湖南农业大学 作者:无城 人气: 发布时间:2010-11-09
摘要:一.实验目的: 学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳技术,检测DNA的纯度,DNA的构型,含量以及分子量的大
一.实验目的:
  学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳技术,检测DNA的纯度,DNA的构型,含量以及分子量的大小。
 
二.实验原理:
  琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖,它具有亲水性且不含带电荷的基团,是一种很好的电泳支持物,DNA分子在碱性环境中带负电荷,在电场作用下向正极泳动,不同的DNA片段由于电荷、分子大小及构型不同,在电场中所受的动力及琼脂糖交联分子的阻力不同,小分子及构型紧密的分子泳动较快,大分子则较慢,大小相同的分子形成一条带,于是达到了分离DNA分子的目的。
 
三.实验材料: 菌种 Ecoli.INVαF(pUC19)
 
四.实验仪器、器皿及试剂:
   仪器、器皿(见附录)
   试剂:1.电泳缓冲液: 5×TBE pH8.0(使用浓度为0.5×)
        配制:称取54.0gTris,27.5g硼酸,加入20ml 500mmol/l的EDTA,先加800ml重蒸水,加热溶解后,再加重蒸水定容至1000ml。
2.1mg/ml溴化乙锭溶液 (EB)
        配制:带手套谨慎称取1mg溴化乙锭,溶于1ml重蒸水中,置4℃冰箱备用。(EB是DNA的诱变剂,亦是强致癌屋,操作时应小心!)
3.琼脂糖:视实验要求制不同浓度的胶,用0.5×TBE作溶剂配制。
        4.0.2% 溴酚蓝,50%蔗糖指示剂(Loading buffer)
          配制: 称取溴酚蓝100mg,加重蒸水5ml,在室温下过夜,待溶解后再称蔗糖25g,加重蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中,摇匀后加重蒸水定容至50ml,加NaOH1-2滴调至蓝色。
 
五.实验步骤:
1.      琼脂糖凝胶的制备: 琼脂糖凝胶的浓度一般为0.5%-1.5%, 称取1g琼脂糖于250ml的三角瓶中,加入100ml 0.5×TBE于微波炉内充分加热煮沸,慢慢冷却至50℃以下,电泳平板洗净后晾干,两端封上胶布,置于水平板上,架上梳子后倒入凝胶液4-5mm厚,待凝胶充分凝固后,撕下两端胶布,置于电泳槽内,加入电泳缓冲液至浸没胶0.5mm左右,轻轻拔出梳子,接上电源,明确电源极性。
2.      样品准备:电泳样品DNA的量由电泳所跑的带的数量而定,一般为2-800ng,质粒DNA一般为两条带,这是由同种分子构型差异而形成的,点样量为300ng左右。
          吸取质粒DNA    pUC19 12ul
          TE或重蒸水           4ul
          Loading buffer          4ul
3.      点样
4.      开稳压电源,电压调整至1-5V/cm,电泳3-4小时。
5.      染色: 电泳后的凝胶,置于含溴化乙锭0.5ug/ml(EB)的蒸馏水或TBE染色0.5h,为方便起见,常在电泳时在电泳液中加EB或直接在凝胶中加入EB。
6.      观察电泳结果:将凝胶置于透射式紫外检测仪上,在紫外灯下可见荧光带。
7.      绘出电泳带草图。
 
思考题:
1.      简述DNA分子大下电泳确定法。
2.      凝胶电泳为什么能分离不同构型或分子大小DNA?
3.      你认为迁移率与分子大小是否成直线关系。
 
 

 

作者:无城

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