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植物总DNA的提取、纯化和检测

来源:湖南农业大学 作者:无城 人气: 发布时间:2010-11-09
摘要:植物DNA是进行分子遗传研究的基本对象,提取完整,高纯度的DNA是研究中很重要的一环,在近年来兴起的分子育种中运用尤为广泛,掌握植物DNA的提取方法,了解其原理有其重要意义,本实验在着重于原理的前提下,介绍一种可适用于多种植物的简便方法。 一.实验
植物DNA是进行分子遗传研究的基本对象,提取完整,高纯度的DNA是研究中很重要的一环,在近年来兴起的分子育种中运用尤为广泛,掌握植物DNA的提取方法,了解其原理有其重要意义,本实验在着重于原理的前提下,介绍一种可适用于多种植物的简便方法。
 
一.实验目的:学习植物总DNA的提取、纯化及检测方法
 
二.实验原理:植物DNA的提取首先是机械破碎植物细胞,可采用石英砂或氧化铝研磨法,液氮冷冻研磨法等,在研磨液中含有SDS破细胞膜,蛋白酶水解除DNA结合蛋白,再以有机溶剂除去蛋白、脂类和杂质,乙醇沉淀DNA,这时的DNA为粗制品,含RNA、少量蛋白质、多糖等杂质,经RNase处理再以有机溶剂抽提和乙醇沉淀,可得到较纯的DNA适用于一般的分子育种工作。
 
三.实验材料: 幼嫩植物苗或幼叶
 
四.实验仪器、器皿及试剂:
   仪器、器皿(见附录)
   试剂: 研磨液:  0.45mol/l  NaCl
                 0.1 mol/l   Tris-Cl  (pH7.0)
                 0.1mol/l    EDTA-Na2
                      1% SDS
         70%乙醇   95%乙醇
         氯仿-异戊醇 (24:1) 
         5mol/l  高氯酸钠
         3mol/l  NaAC
         TE:   10mmol/lTris-Cl (pH7.6)
1mmol/l EDTA--Na2 (pH 7.6)
         RNase:  10mg/ml
 
五.实验步骤:
1.       称取植物材料10g,野外采材要经清洗,再以70%乙醇表面消毒后凉干。
2.       将材料置于研钵中,倒入适量液氮捣碎材料并研磨至粉状。
3.       加入20ml研磨液,继续研磨至糊状。
4.       加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)充分混匀,分装于离心管中,平衡。
5.       离心除渣,4,000g 10min,将上清移至一新管。
6.       72℃水浴保温3-4min,加入5mol/l的高氯酸钠(体积比为4:1)
7.       加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)充分混匀,4,000g离心10min。
8.       加入2倍体积的95%低温乙醇,沉淀DNA,可见白色丝状物。
9.       用玻棒搅起丝状物(搅不起的,可离心收集沉淀物),用适量TE溶解。
10.   加RNase至终浓度为50ug/ml,37℃保温30min。
11.   加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1), 4,000g离心10min。
12.   吸取上层水相,加入1/10体积的3mol/l NaAC及2倍体积经预冷的95%乙醇,混匀,在-20℃放置30min,DNA形成纤维状沉淀。
13.   沉淀加入1ml70%乙醇洗涤1次,4,000g离心8min去上清,纸帕吸干。
14.   DNA沉淀真空干燥后溶于TE中。
15.   将DNA粗制品和纯化品点样电泳,设DNA分子量标准,观察DNA纯度,分子大小。
16.   对纯化后DNA样品进行紫外吸收测定,计算DNA浓度和纯度,用坐标纸绘出DNA吸收曲线。
附: DNA纯度鉴定公式:
A260nm/A230nm≥1.8
A260nm/A280nm≥1.8
DNA浓度(ug/ml)=A260nm×50稀释倍数
 
思考题:
1.     研磨液中EDTA的作用是什么?
2.     沉淀粗DNA时不要加NaAc,而纯化后再沉淀时则要加入NaAc,为什么?
 
作者:无城

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