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两种DNA定量方法的比较:光吸收和荧光

来源:未知 作者:无城 人气: 发布时间:2009-08-29
摘要:对微量的双链 DNA 进行定量在各种生物学应用中都显得非常重要,包括标准的分子生物学技术中的应用,例如 cDNA 文库的建立;用于亚克隆的 DNA 片段的纯化;诊断技术中的应用,例如定量 DNA 扩增产物,在药物研究中测定 DNA 分子。 最常用的检测核酸浓度的方法


 

对微量的双链 DNA 进行定量在各种生物学应用中都显得非常重要,包括标准的分子生物学技术中的应用,例如 cDNA 文库的建立;用于亚克隆的 DNA 片段的纯化;诊断技术中的应用,例如定量 DNA 扩增产物,在药物研究中测定 DNA 分子。

最常用的检测核酸浓度的方法就是检测核酸在 260nm ( A260 )处的光吸收。这一方法最主要的缺点就是单链核苷酸和单核苷酸会产生干扰信号。核酸样品中的杂质也会影响结果。光吸收不能区分 DNA 和 RNA, 灵敏度也相对较低(用 1cm 的比色杯在 A260 值为 0.1 时相对应的双链 DNA 浓度为 5 μ g/ml )。 Hoechst 染料是一种非常灵敏的荧光染料。 H33258 选择性的与双链 DNA 结合。在有蛋白的情况下荧光信号并不显著增加,因此可检测和定量低至 10 ng/ml 的 DNA 。分子探针中的 Cyanine 染料如 YO-PRO TM -1 和 YOYO-1 ( cyanine 单体和二聚体)能定量溶液中少至 0.5ng/ml 的 DNA 。另外一种常用的 DNA 探针, PicoGreen TM 可以直接定量 PCR 扩增产物而无需从反应混合物中纯化 DNA ,并且可以检测到 DNA 中少量的重组蛋白的污染 .Hoechst 33258 染料有明显的 AT 选择性 , 而 PicoGreen 试剂则很少有 AT 或 GC 选择性,因此能够对任何来源的 DNA 进行准确定量。

在这里我们给出了一个 DNA 定量的例子,对光吸收 (260nm) 定量和用 PicoGreen TM 进行荧光定量作了比较。我们在这里向大家展示了一台仪器能够根据提取的 DNA 质量选择性使用这两种分析方法的优势 . 用于定量的质粒 DNA 和基因组 DNA 样品用 TECAN GENESIS RSP 150 提取。

实验设置

DNA提取

•  质粒提取

带有 1.2 kb 插入片段的 bluescript vector 转化到 E.coli (DH5 α ) , LB 或者 TB 培养,用 QIAGENR 公司的 QIAprepR 96 Turbo BioRobot Kit 提取

•  基因组 DNA 提取

基因组 DNA 用基因组 DNA 抽提试剂盒从人的血样中提取。

分析过程

提取出来的 DNA 样品用 TECAN GENios PLUS 分别通过测定 260nm 的紫外吸收和测定 485/535 nm 处的荧光进行定量。光吸收在特殊的 UV 平板中测定 (GREINER UV Star? Nr. 655801), 而荧光用黑色平底 96 孔板测量 (GREINER; Nr 655076). 对于 260nm 处的紫外吸收,每孔中加入 100 μ l DNA 溶液。除了样品以外,用λ DNA 梯度稀释样品加入同一板中作标准曲线。用 PicoGreenTM 染料进行荧光定量根据 PicoGreen dsDNA Quantiation Kit (Molecular Probes, P-7589) 说明进行 . 在测量之前溶液振荡 5sec 以充分混合。同样的,用λ DNA 梯度稀释样品作标准曲线。

主要结果:

I.检测方法和检测极限



2.灵敏性的比较:

260 nm 的光吸收 : 大约 50 – 250 ng DNA/ml 。 PicoGreen: 大约 300 pg DNA /ml 。结果表明荧光定量比光吸收灵敏 100 到 1000 倍 . 标准曲线显示了两种方法的线性范围。必须强调的是线性范围和测量体积(尤其是对光吸收而言),闪光次数,稀释方式, DNA 类型等因素有关。

3.质粒和血样DNA结果

a )血样中的 DNA

在有些情况下,血样和 DNA 不够用于紫外吸收定量。人血样中的 DNA 分别用不同方法提取,提取样品的体积和浓度不能用于光吸收定量。

1 . 10 μ l blood fresh/EDTA 2. 20 μ l blood fresh/EDTA

3 . 10 μ l blood fresh/Citrate 4. 20 μ l blood fresh/Critrate

5 . 10 μ l blood old/EDTA 6. 20 μ l blood old/EDTA

7 . 10 μ l blood old/Citrate 8. 20 μ l blood old/Critrate

b )质粒 DNA


同一质粒样品用两种方法进行了测定。因为荧光测定灵敏度更高,所以在测定之前对样品作了 100 倍稀释。对两种方法的结果进行了比较:


4 .通过 260/280nm DNA 的纯度

结论

如果 DNA 的来源不好或者得到的 DNA 还有其它的用途, DNA 样品的浓度和体积常不够用于光吸收定量。为了减少 DNA 的用量并得到相对比较准确的值,我们推荐用荧光定量的方法。质粒提取后得到的 50 μ l DNA 对光吸收测定足够了。从人血样中得到的 50 μ l DNA 浓度约在 1- 5 μ g/ml 之间,因此得到的 DNA 不够光吸收定量。

这一应用实例清晰的向我们展示了一套仪器集成两种方法的优势。这两种方法各有千秋。 DNA 提取方法不一样;得到的 DNA 量不一样,可根据情况选择不同的方法。尽管会受到 RNA , ssDNA 和单核苷酸和污染物(如酚, EDTA )的影响,但紫外吸收定量操作简单,价格便宜,而且可以快速检查 DNA 纯度 (260/280nm ratio) 。相比之下,荧光定量提供灵敏度高,选择性的与双链 DNA 结合使其大大扩展了定量检测范围。

作者:无城

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