欢迎来访Www.Ggene.Cn,基因时代为生命科学提供源动力!

网站地图帮助中心

二级
导航

TRAP法端粒酶活性检测实验操作方法及疑难解答

来源:未知 作者:编辑 人气: 发布时间:2016-09-30
摘要:Kim应当不会预测到,他在1994年发明的TRAP会那么受欢迎,被一代又一代的研究者奉为端粒酶活性检测首选方法。不过,TRAP法虽然灵敏度高,却同样存在瑕疵。下面为大家介绍的是根据TRAP法适当改良的研究专用试剂盒具体情况和使用方法以及常见问题解答。 本品与

Kim应当不会预测到,他在1994年发明的TRAP会那么受欢迎,被一代又一代的研究者奉为端粒酶活性检测首选方法。不过,TRAP法虽然灵敏度高,却同样存在瑕疵。下面为大家介绍的是根据TRAP法适当改良的研究专用试剂盒具体情况和使用方法以及常见问题解答。

本品与通常的端粒酶活性测定法相比较,具有以下特征:

·内标与端粒酶提取液在同一管里进行PCR 扩增,提高了检测的准确性。

·提供了阳性对照,可以更加准确地判定阳性实验结果。

·优化了引物设计,使PCR 效果进一步提高。

使用须知

本试剂盒为研究用试剂,不能将其作为诊断或临床检测试剂使用。

背景知识

端粒酶是合成染色体末端的端粒的酶。端粒(telomere)是真核细胞染色体的天然末端,由上千个6 碱基重复序列(TTAGGG)组成,是细胞必需的遗传组分,它的作用是维持端粒有足够的长度,保证基因信息在复制过程中的准确性,以防止染色体末端遗传信息的丢失。在正常情况下,每个细胞分裂周期都会使端粒变的越来越短,当端粒短到一定程度时就会发出信号,细胞停止分裂。

端粒酶由RNA 和蛋白质亚基组成,是基本的核蛋白逆转录酶,在细胞染色体复制过程中,能够以自身RNA 为模板,在染色体3’末端合成重复序列,维持端粒的长度。端粒酶在正常体细胞中的活性被抑制,但是大量的资料表明在一些恶性肿瘤中的表达高达85%。由于端粒酶特异地表达于各种肿瘤细胞,并且是大多数肿瘤细胞持续分裂所必需的。因此,端粒酶活性是诊断多数恶性肿瘤、判断愈后的良好指标。

基本原理

利用端粒酶在体外可以以其自身RNA 的模板区为模板,在适宜的寡核苷酸链的末端添加6 个碱基的重复序列的特性,采用PCR 方法扩增此重复序列,并进而用聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳显示6 个碱基差异的梯带。1994 年Kim 建立的TRAP 法,其主要原理如下:首先合成一个18nt 的TS 做上游引物,端粒酶结合TS 末端的GTT 并合成AGGGTTAG,然后每经过一次转位合成一个ggttag 的6 碱基重复序列,端粒酶灭活后,加入CX 做下游引物,经过多次变性-退火-延伸,扩增端粒酶延伸产物。

我公司提供的PCR端粒酶活性检测试剂盒基于同样的的原理,利用银染技术检测端粒酶的活性。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6bp 的梯状条带,条带的多、寡、深或浅表示端粒酶活性的大小。TRAP-银染法保留了传统TRAP 法灵敏度高、特异性强等优点,避免了同位素的放射污染。同时,还增设了内标准物,提供阳性对照品,优化了引物设计,使PCR效果进一步提高,使之能够高灵敏的检测到细胞和组织提取物中端粒酶的活性。

TRAP-银染法端粒酶活性检测试剂实验方法

试剂盒组份

组分 50 次实验量

Wash buffer 11ml

Lysis buffer 2.2ml

10×PCR buffer 140μl

dNTPs 165μl

Primer1 165μl

Primer2 28μl

Primer3 110μl

Taq -DNA Polymerase 17μl

ddH2O 750μl

阳性对照模板 55μl

内标准模板 55μl

操作步骤

1、端粒酶的提取

⑴ 手术后取下的活组织,立即保存在液氮之中。

⑵ 40~100mg 冷冻(-70%℃)组织用无菌眼科手术剪尽量剪碎,研磨器研磨,加入40 ul Lysis buffer(使用前每ml Lysis buffer 加入2μlβ-巯基乙醇);或1~2×106 沉淀细胞直接加入40μl 预冷的Lysis buffer,悬浮细胞,涡旋振荡10s, 置冰浴中30min,每间隔数分钟涡旋振荡一次,共5-6 次。

备注:为了获取比较理想的端粒酶提取液,建议在一些干硬组织中适当加入Washbuffer。

⑶ 4℃离心(13000rpm,20min)。

⑷ 移取上清,分装3-4 管,每管约20μl。其中一份样品用于蛋白质浓度定量,其余迅速冷冻,-70℃保存。

2、 PCR 扩增(1×25ul)

Ⅰ液(μl) Ⅱ液(μl)

ddH2O 7.5 5.5

10×buffer 0.5 2

dNTPs 0.5 2.5

Primer1 0.5 2.5

Primer 2 0 0.5

Taq-DNA polymerase 0 0.3

内标准模板 1 1

Primer 3 2 2

3、 PCR 扩增:

⑴ 每管加入Ⅰ液9μl 及端粒酶提取液1μl,混匀,30℃反应30min。

⑵ 上述各管93℃加热1min 灭活。

⑶ 向上述各管中加入预热至93℃的Ⅱ液各13ul,混匀,进行第一步扩增。扩增

条件如下:

第一步:

步骤 时间 温度

预变性 3m 93℃

变性 35s 93℃

退火 35s 42℃

延伸 90s 72℃

循环数 5

延伸 60s 72℃

⑷ 在第一步扩增最后一个循环的延伸一步的最后几秒,暂停仪器运行,快速向各管中加入primer3 2ul 和内标准模板1ul。继续运行仪器,进行第二步扩增。扩增条件如下:

第二步(连接第一步):

步骤 时间 温度

预变性 60s 93℃

变性 40s 93℃

退火 40s 60℃

作者:编辑

上一篇:重组质粒的连接、转化及筛选

下一篇:没有了

最火资讯

Copyright 2008-2015 Powered By Ggene.Cn.
鄂ICP备15005758号-1

声明:本网站尊重并保护知识产权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果我们转载或引用的作品侵犯了您的权利,请通知我们,我们会及时删除!