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X-Gal的作用机理及IPTG-X-gal平板制作方法

来源:未知 作者:编辑 人气: 发布时间:2016-09-30
摘要:一、简介 X-Gal在-半乳糖苷酶的催化下水解后呈蓝色,因此常用于转基因筛选试验中,如蓝白斑筛选或-半乳糖苷酶的原位染色检测实验。蓝白斑试验中主要根据菌落呈现的颜色即可简单的挑选出哪些是转化子。 分子式为C14H15BrClNO6,分子量为408.63,CAS Number 72

一、简介

X-Gal在β-半乳糖苷酶的催化下水解后呈蓝色,因此常用于转基因筛选试验中,如蓝白斑筛选或β-半乳糖苷酶的原位染色检测实验。蓝白斑试验中主要根据菌落呈现的颜色即可简单的挑选出哪些是转化子。

分子式为C14H15BrClNO6,分子量为408.63,CAS Number 7240-90-6。

X–Gal是β–半乳糖苷酶(β–galactosidase)的底物,水解后呈蓝色。基于这个特点,pUC系列载体DNA(或其他带有lacZ 基因载体DNA)以lacZ 缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体载体DNA进行转染时,如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG,由于β–半乳糖苷酶的α–互补性,可以根据是否呈现白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑选出基因重组体。

二、使用方法 :

首先把X-Gal配制成20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液(-20℃避光保存),然后在100 ml的琼脂培养基中,加入200 μl的上述溶液、100 μl的IPTG(24 mg/ml)和100 μl的Amp(100 mg/ml),制作成X-Gal、IPTG、Amp平板培养基。当dna片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体),然后转化至lacZ缺失细胞中后,涂布上述的X–Gal、IPTG、Amp平板培养基,可根据长出菌体的蓝白色,而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。

三、注意事项 :

1、培养噬菌体时,Top agar中的添加量为:50 μl/3 ml(20mg/ml)。

2、含有X-Gal的培养基4℃避光保存,须在1~2周内使用。

四、IPTG-X-gal 平板制作

1、IPTG储液配置:一般将IPTG配成20%(m/V)(约0.84M)的母液。称取0.5克 IPTG粉末,用2 ml蒸馏水将其完全溶解后,补加蒸馏水至2.5ml,用孔径0.22 μm的小型注射型过滤器(预先装好滤膜灭菌备用)过滤除菌,-20 ℃冻存。

2、X-gal储液配置:用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的贮存液。称取0.2克X-gal,加入10ml二甲基甲酰胺(DMF),溶解后保存于一小血清瓶内,装有X-gal溶液的血清瓶须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏,并应贮存于-20℃。X-gal溶液无须过滤除菌。

3、IPTG-X-gal平板制备:在含氨苄或卡那抗生素平板上,滴加40 µL的X-gal储液及5 µL的IPTG储液(怕体积过小影响涂布均匀,可适当稀释后再涂布),涂布均匀后晾干后使用。在临使用前提前1h制备。

注:为方便实验操作,试验中也可以将X-gal和IPTG的储备液按照菌液体积和平板数量计算好浓度,直接加入到准备用于涂平板的细菌培养液中,混匀后即可涂平板,这样可以节省试验时间。若经过培养后长出的菌落蓝白斑显示的不够明显,可以将平板放入4度冰箱里,过一段时间以后菌落的蓝白斑就显示的比较清晰了。

作者:编辑

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