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Gateway技术进行克隆和表达

来源:生物通 作者:无城 人气: 发布时间:2016-08-12
摘要:Gateway 技术提供以下可能: 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间 时将您的基因转入到多个表达系统 在任何您选择的系统 ―― 体外,细菌,酵母,昆虫,或哺乳动物 ―― 分析表达 (我们提供的产品正在不断的扩展。如需要广泛的信息资源,请联系技术服务或

Gateway™技术提供以下可能:

  • 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间

  • 时将您的基因转入到多个表达系统

  • 在任何您选择的系统――体外,细菌,酵母,昆虫,或哺乳动物――分析表达

  • (我们提供的产品正在不断的扩展。如需要广泛的信息资源,请联系技术服务或登录www.invitrogen.com/gateway


     

 


一种更好的克隆方法
    Gateway™技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统(图1)。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤,而同时典型的克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时,还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway™也有助于进行带不同数目纯化和检测标签的表达。

    Gateway™利用了位点特异重组,所以在构建入门载体后,不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆,就可以多次使用它,转移您感兴趣的基因到Gateway™改造过的 的各种表达载体(目的载体)。

    此外,由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变,因而您不必再为新的表达克隆的测序担心。在使用每一种新的表达系统时,将会节省您更多的时间。


图1-Gateway™技术的灵活性
*目的基因克隆进入门载体后,
可以同时转移目的基因到多个目的载体


一种强大而可靠的技术
    Gateway™技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统,便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统,DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。
   Gateway™技术是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统(attB x attP →attL x attR)。BPLR两个反应就构成了Gateway™技术(表1和图2)。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应,创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。

    Gateway™技术也利用了ccdB选择方法,确保高效率的分离重组克隆。典型的效率是>95%。需要了解更多的有关ccdB的信息,请参考术语表。

表1-反应和术语总结
反应 反应位点 产物 产物结构
BP反应 attB x attP 入门克隆 attL1-基因-attL2
LR反应 attL x attR 表达克隆 attB1-基因-attB2

完成构建Gateway™表达克隆仅需两步(图2):

  1. 创建入门克隆,通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。

  2. 混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway™ LR Clonase™酶,产生表达克隆。(表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。)

2-Gateway™技术总结

 在BP反应中基因转移形成入门克隆,在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。

    可以通过以下几种方法构建Gateway™入门载体。无论您选择何种方法,创建的入门载体都是用来与各种目的载体进行重组。图3-Gateway™定向TOPO®克隆

PCR克隆(定向TOPO®克隆至入门载体或与供载体BxP重组)

  • 限制性内切酶消化和连接进入入门载体

  • 使用pCMV·SPORT6pEXP-AD502*构建Gateway™兼容cDNA文库

  • Gateway™改造过的克隆资源*

( * 这些克隆资源和cDNA文库两边加有attB位点。这些克隆可以通过与供载体及BP Clonase™酶反应转换到入门载体。请登录www.invitrogen.com获得已有克隆资源的更多信息。)

PCR-定向(PCR-Directional)TOPO®克隆
    定向TOPO®克隆使得克隆PCR产物和其它的DNA分子更加快速和有效。进行5分钟的简单连接,产生>90%的重组子。您不仅会比用连接酶介导的方法更快的获得克隆,而且可以节省因第一次无结果而重复试验所额外浪费的时间。

    定向TOPO®克隆提供高效的一步法克隆策略,可以定向克隆平端PCR产物到入门载体。平端PCR产物定向克隆的效率>90%,从而简化了筛选。同时不再需要连接酶、PCR后续步骤或限制性内切酶。

    目前有两种定向TOPO®克隆载体:pENTR/D-TOPO® pENTR/SD/D-TOPO®(表2和图3),它们具有有以下特点:

  • 位于PCR产物插入位点两侧的attL重组位点可以与Gateway™目的载体进行有效重组

  • 通用M13位点便于测序

  • 基于pUCori位点提供高产量质粒

  • 大肠杆菌中卡那霉素(kanamycin)抗性基因筛选

2-两种pENTR/D-TOPO®载体的简单比较

入门载体 特点 优点
pENTR/D-TOPO® SD(Shine-Dalgarno)位点 真核细胞中天然、N-C-端融合;大肠杆菌中N-端融合;如果基因包含有SD序列,可在大肠杆菌中进行C-端或天然蛋白表达
pENTR/SD/ D-TOPO® SD(Shine-Dalgarno)位点 包含基因10和一个SD序列,可以有效的启动天然蛋白和融合蛋白在大肠杆菌中的表达

构建入门载体的各种选择

作者:无城

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