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聚合酶链式反应步骤、体系及问题分析

来源:未知 作者:编辑 人气: 发布时间:2016-10-08
摘要:聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学常用技术,是体外扩增DNA的方法,设计生物学的各个领域,基本是进了实验室都必须掌握的技术。对于刚入生物门的我们简单了解其步骤、反应体系很有必要。 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction ,PCR)步骤 img alt=聚合酶

聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学常用技术,是体外扩增DNA的方法,设计生物学的各个领域,基本是进了实验室都必须掌握的技术。对于刚入生物门的我们简单了解其步骤、反应体系很有必要。

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction ,PCR)步骤

<img alt="聚合酶链式反应步骤、体系及问题分析" 聚合酶链式反应步骤、体系及问题分析"="" border="1" height="520" data-cke-saved-src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120606/1A223OE-0.jpg" src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120606/1A223OE-0.jpg" width="525" style="vertical-align: middle; border: 0px;">

三步:

1 变性:模板DNA加热变性

2 退火 引物与它的靶序列发生退火,引物DNA量多,使引物和模板在局部形成杂交链

3 延伸 4种dNTP 与 Mg2+ 存在的条件下,DNA合成酶催化以引物为起始点,按5'-3'方向进行延伸。

上面三步为一个循环,可使拷贝数到达2*E-6-2*E-7

PCR 产物一段双链DNA,是由它的末端引物的5’端决定的。

PS:

1.首轮扩增,其产物是大小不均一的DNA分子。长度应大于两引物之间的长度。

在第二个循环中,由于5'固定,其产物长度就由等于两引物之间的长度。所以几十个循环后就会产生

大量的两引物之间序列。

引物设计:

1,长度15~30个核苷酸,最多到50个核苷酸左右。

2, 尽量避免嘌呤和嘧啶堆积的现象。(其实有时很难避免,不是很重要)。

3,引物内部不应该形成二级结构,如果引物中有酶切位点时,就会出现引物二聚体。(一般不是很重要)

PCR的反应条件

1,dNTP浓度过高会加快反映速度,但同时还可以增加碱基的错误掺入率。

2, 引物浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增。

3,TaqDNA聚合酶浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增,低则合成产物量减少。

TaqDNA聚合酶无校正功能,掺入错误率达2*E-4个核苷酸,一个30个循环的扩增反应0.1%-0.25%总错误率。

4, 在90~95度下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94~95度30~60s。时间过长使

TaqDNA聚合酶失活和dNTP破坏增多。

5,DNA很快冷却到40~60度使引物和模板结合。引物长度在15~25时退火温度

Tm=4(G+c)+(A+T),一般在45~55度,温度低容易退火但特异性低;温度高,不容易退火但特异性高。退火时间30秒。

6,延伸温度一般在70~75度这是TaqDNA聚合酶活性最高(150个/S),当引物在16个碱基以下时可采用缓慢升高温度到70~75度的方法,使在低温下就开始合成。一般<1KB时间1分钟即可。当〈1KB时在较后的循环中延长扩增时间。

7循环次数25~30次。

无产物时对策:

1,取10ul扩增混合液作模板在进行PCR扩增。

2,增加TaqDNA聚合酶浓度

3,增加循环次数

4,降低退火温度

5,加靶DNA量

PCR时常会遇见电泳没有条带,基因片段扩增不出来,最主要的原因就是引物设计不合理、退火温度问题、DNA中蛋白杂质较多、PCR反应体系有漏加的物质如dNTP等。

作者:编辑

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