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Primer Premier 5.0与Beacon Designer 5.1引物设计教程

来源:基因时代 作者:admin 人气: 发布时间:2009-05-27
摘要:详细介绍引物设计原理,意义通过引物设计软件Primer Premier 5.0和Beacon Designer 5.1设计普通引物,Real Time RT引物

Primer Premier 5.0与Beacon Designer 5.1引物设计教程
 
一、设计原理

1、选择合适的靶序列:设计引物之前,必须分析待测靶序列的性质,选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。

2、长度:一般来说,寡核苷酸引物长度为15-25bp

3Tm值:引物的Tm值一般控制在55-65,尽可能保证上下游引物的Tm值一致。若G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退货温度。

4G+C含量:有效引物中的G+C含量一般为40%-60%

5、碱基的随机分布:引物中四种碱基的分布最好是随机的,不存在聚嘌呤和聚嘧啶,尤其在引物的3端不应超过3个连续的GC

6、引物末端:只有引物的3端与模板结合,PCR才能进行,所以3端最好是GC

7、引物自身:引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列,否则会影响到引物与模板之间的结合,尤其避免3端的互补。

8、引物之间:上下游引物之间尽量少的存在互补序列,否则上下游引物退火结合,将影响到PCR的扩增效率。

二、序列查找

根据所需检测的待检定基因,在

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide&itool=toolbar网址查询有关序列。

三、引物设计与筛选

    分别以Primer Premier 5.0Beacon Designer 5.1软件为例,进行引物设计和筛选。

(一)、Primer Premier 5.0软件

    1、打开软件,调入序列

2、选择序列文件名,加入右框

3、序列显示如图,

4、点击“Primer”,按照引物设计的原理,设定引物的各种参数,点击“OK”进行引物搜寻

5、等待引物搜寻,显示结束后,点击“OK”,进入下一页,

6、按照搜寻结果显示,逐条分析,在主窗口中检查该引物对的二级结构,依次筛选

(二)、Beacon Designer 5.1软件

1、打开软件,调入序列

2、选择序列文件名,加入右框

3、序列显示如图,

4、选择引物设计方式

 

 

5、点击“Primer Search(图标 )”,按照引物设计的原理,设定引物的各种参数,点击“Search”进行引物搜寻

6、等待引物搜寻,显示结束后,点击“OK”,进入下一页,

7、按照搜寻结果显示,逐条分析, 点击“All Structures”,检查该引物对的二级结构,依次筛选

四、引物比对

比对设计的引物是否满足需要和引物的特异性,在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

网址进行比对

   1、输入所需比对的序列,选择数据库“nr

2、点击“Blast”,进入下一页

3、点击“Format”,进入比对结果

 

 

 

作者:admin

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