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生物安全实验室病毒悬液灭活试验方法标准转化研究

来源:未知 作者:编辑 人气: 发布时间:2016-09-05
摘要:邓阿妹1,魏 凤1,吴 佳2,马海霞2,袁志明2 ( 1. 中国科学院武汉文献情报中心,武汉 430071; 2. 中国科学院武汉病毒研究所,武汉 430071) 【摘要】 化学消毒剂常用于病毒的灭活和实验室环境的消毒,其对病毒灭活的效果及评价直接影响实验室 的生物安全。
邓阿妹1,魏 凤1,吴 佳2,马海霞2,袁志明2
( 1. 中国科学院武汉文献情报中心,武汉 430071; 2. 中国科学院武汉病毒研究所,武汉 430071)
【摘要】 化学消毒剂常用于病毒的灭活和实验室环境的消毒,其对病毒灭活的效果及评价直接影响实验室 的生物安全。鉴于目前我国尚缺乏对化学消毒剂杀病毒效果的评价标准,本文在对欧盟现行的化学消毒剂杀病毒 定量悬浮试验标准的研究分析的基础上,结合我国生物安全实验室的管理现状,提出了欧盟现行标准转化的方案。 建议以包括高致病性病毒的替代病毒在内的6 种病毒作为试验用的模式病毒,同时增加残留化学消毒剂的去除方 法和试验结果95%置信区间计算方法内容。该建议提高了标准的科学性和可操作性,并为我国实验室消毒灭菌标 准制定提供了参考。
【关键词】 病毒灭活;化学消毒剂;生物安全;标准;定量悬浮试验;杀病毒效果评估
【中图分类号】R33 【文献标识码】A
【文章编号】 16717856(2016) 02002706 doi: 10. 3969. j. issn. 1671 -7856. 2016. 02. 006

生物安全实验室活动涉及对包括病毒在内的 多种高致病性病原微生物的操作和研究。采取消和病毒向实验室外环境泄露的重要手段。消毒方 法不当极易造成人员的感染和病毒的传播,从而导 致极其严重的生物安全事故。2004 年北京发生了 实验室 SARS 冠状病毒感染事件。事后查明,是由 于采用未经论证和效果验证的非典病毒灭活方法, 在不符合防护要求的普通实验室内操作冠状病毒 感染材料造成的[1]。因此,做好消毒工作对于生物 安全实验室的正常运行和人员的生命安全具有非 常重要的意义。

利用化学消毒剂对病毒污染物进行消毒需要 对病毒灭活的效果进行正确、科学的评价。目前, 国际上主要采用病毒悬液灭活试验法和病毒载体 灭活试验法在实验室条件下对化学消毒剂的杀病 毒活性进行检测和评估,其中病毒悬液灭活试验法 因操作相对容易而成为最常使用的方法[2 -4]。病毒 悬液灭活试验法是在实验室中模拟实际使用条件 对化学消毒剂杀病毒悬液的活性进行测试和验证, 其结果可作为实际生活中选择化学消毒剂和评估 杀病毒效果的主要参考依据。一些国家已将该方 法作为标准推出以规范对该方法的使用,如欧盟标 准 NF EN 14476“化学消毒剂和防腐剂 —人类医学 中化学消毒剂和防腐剂的杀病毒定量悬浮试验 — 试验方法和要求”就是一个在欧盟被广泛使用、同 时也被国际社会接受的标准。随着科学技术的进 步和研究的深入,人们对于病毒性质和传播机制的 了解逐步加深,这为病毒悬液灭活试验方法标准的 改进和优化提供了有利条件。

基于中法生物安全标准化领域的研究与合作, 本研究针对化学消毒剂杀病毒定量悬浮试验这一 方法标准开展相关分析和研究,希望通过调研和追 踪该方法的最新研究进展发现标准存在的不足,并 提出改进建议,为我国制定杀毒灭菌相关标准提供 参考。

1 研究目标和方法
本研究的研究目标有 3 点:
( 1) 对法国欧盟标 准 NF EN 14476“化学消毒剂和防腐剂 — 人类医 学中化学消毒剂和防腐剂的杀病毒定量悬浮试验 — 试验方法和要求( 第2 阶段第1 步) ” [5]的内容进 行深入分析。该标准由欧盟委员会于2005 年发布 并被法国转化为国家标准。在内容上,该标准包括 了“范围”、“规范性引用标准”、“术语和定义”、“试 验要求”、“材料和试剂”、“试验方法”、“用于指定病毒的试验程序”、“试验数据的计算”、“试验结果 的表示”和“附录”等 10 个部分。通过对标准内容 的深度分析,全面掌握标准涉及的关键信息;
( 2) 通 过检索分析的方法,利用 Web of Science 数据库对 相关论文进行检索。Web of Science 数据库收录了 从1970 年至今的8000 多种世界范围内最具有影响 力的、经同行专家评审的高质量的期刊。本研究利 用“disinfectant”、“virus inactivation”、“virucidal activity”、“quantitative suspension test”等关键词对该 数据库中2005 至 2015 年 10 年间全球发表的消毒 灭菌相关论文进行检索。通过文献调研的方法对 检索到的科技文献加以深度分析和研究,联合专家 咨询的方法以期详细掌握化学消毒剂杀病毒悬液 试验方法的研究进展。
( 3) 掌握化学消毒剂杀病毒 定量悬浮试验方法标准在相关国家的应用状况。 通过以上 3 个目标的研究和分析,将掌握的该 领域的研究进展与法国欧盟标准NF EN 14476 开展 比对分析,结合对标准实际应用情况的调研,对标 准的内容给出改进和完善的建议。
2 标准 NF EN 14476 内容解析
标准NF EN 14476 规定了化学消毒剂杀病毒定 量悬浮试验的方法和最低要求,篇幅较长、内容较 多、信息量大。需对内容的关键信息进行总结和提 炼,以便于同文献中的相关信息进行比对分析。现 将该标准内容的关键信息及特点进行总结,如表1。 标准 NF EN 14476 从制定到现在已过去10 多 年,上述表中涉及的一些技术和方法是当时科学研 究所取得的成果,代表着当时科学技术的水平,该 标准的提出和制定也是根据当时的科学研究的状 况和实际的需求。随着时代的发展和科技的进步, 该标准涉及的方法和技术是否落后? 该标准是否 还适用于当今的科学研究? 是否能满足当今实际 工作的需要? 这些都是必须思考的问题。
3 标准 NF EN 14476 的分析和优化
根据对文献信息的深度挖掘和分析,化学消毒 剂杀病毒悬液试验方法在试验模式病毒的种类、试 验病毒的替代病毒、残留化学消毒剂的去除方法、 对照和对比试验的设置及试验结果的计算和分析 等方面均取得了新的研究进展和成效。针对标准 NF EN 14476,可以在这些方面对其进行优化,下面 展开具体论述。
3. 1 试验模式病毒的种类分析

在实验室环境下进行化学消毒剂杀病毒定量 悬浮试验时,设定试验的模式病毒非常必要。由于 病毒种类繁多、性质各异,任何实验室都无法达到 条件来测试所有消毒剂对全部已知病毒的杀灭活 性,因此需采用模式病毒进行试验。试验模式病毒 需具备安全性高、稳定性高、可操作性强、易增殖等 特点。目前,世界上对于模式病毒没有统一的规 定,各国都在积极寻找各种核酸类型的病毒作为试 验的模式病毒。 标准 NF EN 14476 规定的试验模式病毒有3 种,分别是作为无包膜 RNA 病毒类代表的类型1 脊 髓灰质炎病毒( 毒株为 LSc2ab) 、作为无包膜 DNA 病毒类代表的类型 5 腺病毒( 毒株为 adenoid 75 和 ATCC VR5) 和作为耐热病毒类代表的牛细小病毒 ( 毒株为 Haden 和 ATCC VR767) 。根据有无包膜 结构,病毒分为包膜病毒和无包膜病毒两大类。包 膜结构对化学消毒剂比较敏感,一般认为,无包膜 病毒对化学消毒剂的抵抗力强于包膜病毒,如果化 学消毒剂对无包膜病毒具有杀灭活性,那么它对包 膜病毒也应具有杀灭活性。但是,由于病毒性质的 巨大差异,事实情况却并非如此,例如,含乙醇或甲 醛的消毒剂可将无包膜的脊髓灰质炎病毒灭活,却 不能将包膜病毒 SV40 灭活。事实上,除了无包膜病毒之外,包膜病毒也可以作为试验的模式病毒。 痘苗病毒( VACV) 、牛病毒性腹泻病毒( BVDV) 和 猴多瘤病毒40( SV40) 拥有模式病毒要求的诸多特 点,具备作为模式病毒的潜力。为此,研究者们开 展了大量的研究工作,从实践上证明了这3 种包膜 病毒作为模式病毒的可行性[6 -11]。 标准NF EN 14476 仅将无包膜病毒作为试验的 模式病毒,忽视了包膜病毒作为模式病毒的必要 性,从这一点来说,该标准不够科学和严谨。因此, 应对标准NF EN 14476 的试验模式病毒的种类进行 扩充,在已有模式病毒的基础上将 VACV、 BVDV 和 SV40 作为评估化学消毒剂对包膜病毒杀灭活性的 模式病毒。标准NF EN 14476 试验模式病毒优化前 后对比见表2 所示。

3. 2 试验病毒的替代病毒分析

在实际生活中,存在一些如乙型肝炎病毒 ( HBV) 、丙型肝炎病毒( HCV) 、诺如病毒、 SARS 冠 状病毒( SARS-CoV) 等流行度高、致病性强、危害性 大的病毒,给人类的健康造成了极大威胁。实验室 条件下检验化学消毒剂对这类高危病毒的杀灭活 性时,仅使用模式病毒是不够的。直接利用这些病 毒作为试验病毒理论上是最科学的,但是,由于这 些病毒具有极强的感染性和致病性,而且还存在体 外增殖困难的缺点,在实际操作上是不可行的。为
表3 化学消毒剂杀病毒活性的试验病毒与替代病毒
试验病毒( 英文缩写) 替代病毒( 英文缩写) 乙型肝炎病毒( HBV) 鸭乙型肝炎病毒( DHBV) 丙型肝炎病毒( HCV) 牛病毒性腹泻病毒( BVDV) 人诺如病毒 鼠诺如病毒( MNV) ;猫杯状病毒( FCV) SARS 冠状病毒( SARS-CoV) 牛冠状病毒( BCV) ;禽传染性支气管炎病毒( IBV) 痘苗病毒( VACV) 改良安卡拉痘苗病毒( MVA) 

了解决这些问题,学者们开展了替代病毒的研究, 以期发现或改造一些与这些病毒结构和属性类似、 对人体不致病或致病性较弱且易于体外增殖的病 毒来代替高致病性病毒开展试验。研究者们发现, 可用鸭乙型肝炎病毒( DHBV) 代替 HBV[12]、用 BVDV 代替 HCV[13]、用鼠诺如病毒( MNV) 或猫杯 状病毒( FCV) 代替人诺如病毒[14, 15] 、用牛冠状病毒 ( BCV) 或禽传染性支气管炎病毒( IBV) 代替 SARSCoV [16]开展化学消毒剂对以上高危病毒杀灭活性 的试验。另外,虽然要求试验模式病毒对人体应具 有安全性,但实际上,一些模式病毒仍可以使人体 致病,寻找更加安全的模式病毒替代它们也是研究 者们关心的问题[17]。改良安卡拉痘苗病毒( MVA) 是痘苗病毒经过人工改造后的变异体,丧失了对人 体的感染能力。有研究表明,改良安卡拉痘苗病毒 可以作为痘苗病毒理想的替代物[18]。目前,研究者 们还没有寻找到合适的病毒来替代脊灰病毒作为 模式病毒,这将是未来研究工作需要解决的问题。 标准 NF EN 14476 没有涉及试验病毒的替代病毒, 有必要依据以上研究结果对其进行补充和完善。 以上病毒及替代病毒总结如表3。
3. 3 残留化学消毒剂的去除分析
试验过程中残留的化学消毒剂会使细胞培养 物中毒,导致试验结果的可靠性降低,因此有必要 将其去除。标准 NF EN 14476 中,对毒性较低的化 学消毒剂采用稀释法将其去除,对毒性较高且稀释 法无法取得理想效果的化学消毒剂,采 用 SephadexTMLH20 凝胶过滤技术将其去除。标准 NF EN 14476 涉及的这两种方法在实际应用上都存在 缺陷。由于化学消毒剂种类繁多、性质复杂,对毒 性较低的化学消毒剂仅采用稀释法往往达不到预 期的去除效果,且稀释过程还会延长化学消毒剂和 病毒的接触时间。另外,利用 SephadexTM LH20 凝 胶去除毒性较高的化学消毒剂也存在以下两点弊 端:( 1) 去除过程耗时长,至少需要 2 min 甚至更长 时间,这明显延长了病毒与化学消毒剂的接触时 间;( 2) 适用化学消毒剂的范围较小,仅适用于少数 的化学消毒剂,对大部分的化学消毒剂都不适用。
鉴于以上问题,有学者建议采用中和稀释法去除低 毒性的化学消毒剂,即先用中和剂中和,再用稀释 法进行连续稀释,即可实现残留化学消毒剂的有效 去除[19]。此外,法国学者介绍了两种新型凝胶 SephadexTM G10 和 SephadexTM G25 在去除高毒性 化学消毒剂上的应用,这两种凝胶相比 SephadexTM LH20 凝胶具有明显优势,不仅适用于绝大多数的 化学消毒剂,而且去除过程仅需1 min,另外,使用成 本也较低[20]。 标准NF EN 14476 在残留化学消毒剂去除上仅 涉及两种物理方法,且这两种方法在使用上均存在 缺陷。因此,应对标准 NF EN 14476 的该部分内容 进行补充和完善,在兼顾物理方法和化学方法的同 时,还应考虑两种新型凝胶 SephadexTM G10 和 SephadexTM G25 的应用。

3. 4 对照和对比实验的设置分析
为了试验结果的可靠性和真实性,也为了便于 对意外结果的分析,在试验过程中需设置多组对照 和对比试验。就化学消毒剂杀病毒定量悬浮试验 来说,需设置的对照实验包括评估化学消毒剂杀病 毒活性的病毒对照实验、评估干扰物对病毒感染性 影响的实验、评估干扰物对细胞影响的实验、评估 化学消毒剂对细胞毒性的实验、评估稀释过程对病 毒感染性影响的实验及甲醛对照实验。标准NF EN 14476 虽在部分章节零星地提到了对照实验的设 置,但缺少对这些对照进行系统性的归纳,且描述 也不够详尽和全面,使标准的使用者对需要设置哪 些对照实验及如何设置没有一个很清晰的理解。 因此,应考虑在标准 NF EN 14476 内容上设立一个 单独章节,对所需的对照实验进行系统条理的归纳 和总结,并对设置方法做详细的说明,使标准的使 用者能够快速准确地理解并掌握对照实验的设置 方法。

3. 5 试验结果的计算分析
标准 NF EN 14476 要求,对试验结果进行计算 时,只需计算出未经化学消毒剂处理的病毒阳性对 照的滴度对数值( logN0) 和反应混合物在各接触时 间点的病毒滴度的对数值( logNx) ,根据两者的差值
( logN0-logNx) 对结果进行分析和判断。如果该差 值不低于4 说明试验化学消毒剂对试验病毒具有杀 灭活性,该化学消毒剂实验室试验合格; 反之则说 明试验化学消毒剂对试验病毒不具有杀灭活性,该 化学消毒剂实验室试验不合格。但是,由于每次试 验存在随机误差,仅计算病毒滴度的对数值是不够 的。研究者越来越倾向于对实验结果置信区间的 计算[21]。基于置信区间的结果分析能够真正地反 映化学消毒剂实际杀病毒活性的不确定度,使试验 结果更加科学、严谨、可信。标准NF EN 14476 对试 验结果的计算要求较简单,不够科学严谨。因此, 对标准 NF EN 14476 该部分内容进行补充和完善 时,应要求每次试验不仅需计算出病毒的滴度值, 还需对结果进行95 %置信区间的计算。

4 对我国相关生物安全工作的启示与建议

根据以上研究,针对我国相关的生物安全工 作,给出以下建议:
( 1) 重视生物安全实验室消毒灭 菌技术方法标准和消毒灭菌效果评价方法标准的 制订,完善生物安全实验室消毒灭菌方法及评价体 系。不仅需要制定针对不同危险等级病毒的多种 消毒灭菌方法,还需考虑空气、管道、仪器设备、防 护服等被病毒污染的介质的消毒灭菌的特殊要求。 建立健全消毒灭菌效果评价方法体系,指导化学消 毒剂科学、合理、安全的使用,规范消毒灭菌方法的 正确实施。此外,应加强对实验室工作人员消毒灭 菌方法技术的培训和指导,增强工作人员的安全防 范意识,提高个人的安全防护知识水平和突发事故 处理技能。管理者应不断完善实验室生物安全防 范措施,强化生物安全管理能力,提高生物安全管 理水平。
( 2) 加强顶层设计,统筹规划和协调,重视 建立生物安全技术的研发体系,提高我国生物安全 技术的研发水平和生物安全产品的国际竞争力。 首先应加强生物安全领域的基础研究,包括病毒基 本性质和传播致病机制的研究、环境风险的起因和 性质研究、风险评估和风险管理的技术研究、实验 室安全操作的技术研究、病原微生物专用检测技术 及专用检测设备的研究等。此外,还应重视对高等 级生物安全技术的研究,包括高致病性病原体隔离 与防护技术的研究,比如结构气密性、风量控制、差 压控制等技术的研究; 化学淋浴消毒和连续消毒等 新型消毒方法及消毒效果评价的技术研究; 正压防 护服、呼吸防护装置等高等级生物防护装备系统的研究等。
( 3) 加强生物安全的国际合作与交流,了 解世界生物安全的发展动态和趋势,吸取国际生物 安全事故的惨痛教训,吸收和引进国际先进的生物 安全技术和方法。学习和借鉴国外在管理、监测、 评估等方面的成功经验,提升我国的生物安全管理 能力。加强对外宣传,树立我国生物安全管理的良 好形象,保障我国生物技术从研究开发到生产应用 对外合作的广泛开展。根据生物安全技术发展的 特点和趋势,结合我国国情,规划我国生物安全的 发展战略、优先行动和重点项目,以完善我国的生 物安全体系和提升我国生物安全的国际化水平。

5 总结

本研究针对法国欧盟标准NF EN 14476 内容的 改进和完善开展了分析和研究工作,根据研究结 果,对标准的内容给出以下几点优化建议:
( 1) 原标准中试验模式病毒的种类可由3 种 ( 脊灰病毒、腺病毒和牛细小病毒) 增加至 6 种( 脊 灰病毒、腺病毒、痘苗病毒、牛病毒性腹泻病毒、猴 多瘤病毒和细小病毒) ,以满足病毒对化学消毒剂 抵抗力多样性的试验需求;
( 2) 在原标准的基础上,可增加实验危险病毒 的替代病毒选项,增加试验方法的灵活性、适应性、 实用性和安全性;
( 3) 原标准提到的残留化学消毒剂去除方法已 经不太适用于当前复杂多变的病毒环境和日益增 多的各式化学消毒剂制品,建议在原标准单纯物理 稀释法的基础上增加化学中和方法,并考虑两种方 法的融合交叉使用。此外,建议使用两种新型凝胶 技术 SephadexTM G10 和 SephadexTM G25 对残留的 高毒性化学消毒剂进行去除;
( 4) 在原标准的基础上可增加全面且详细的对 照和对比实验信息,如评估化学消毒剂杀病毒活性 的对照实验、评估干扰物对病毒感染性影响的对照 实验、评估干扰物对细胞影响的对照实验、评估化 学消毒剂对细胞毒性的对照实验、评估稀释过程对 病毒影响的对照实验及证明试验病毒适用性的甲 醛对照实验,以增强试验体系的科学性和严谨性;
( 5) 在试验结果的计算和分析方面,建议在原 标准方法的基础上增加对试验数据的95 %置信区 间的计算,以提高结果分析的准确性和科学性。 上述的分析研究结果将为我国制定符合国家 发展状况、先进的消毒灭菌方法标准提供借鉴和参考,以促进我国的生物安全标准化水平,帮助我国 生物安全技术和管理水平的进一步提高。因此,我 国不仅要加强生物安全相关技术的研发和应用布 局,也应及时对现有标准进行内容更新和完善,将 最新的研究成果加以应用和推广,满足我国当前生 物安全技术的需求。
 
 
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