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超高效电转化细胞的制备、电击及要点——经过实践检验可靠适用

来源:丁香园 作者:无城 人气: 发布时间:2015-08-06
摘要:最近做了四次电转化,两次成功转化率大于10的9次方,效果非常好 ;另从两次失败转化率吸取了教训;现将试验方案及操作与大家共享: 1.细菌电转化感受态细胞的制备 (方案由李芃同学提供,lzf继承补充) 1)由-70度冰箱中保存得菌种划单菌落,过夜培养16-20h
最近做了四次电转化,两次成功转化率大于10的9次方,效果非常好 ;另从两次失败转化率吸取了教训;现将试验方案及操作与大家共享:

1.细菌电转化感受态细胞的制备 (方案由李芃同学提供,lzf继承补充)

1)由-70度冰箱中保存得菌种划单菌落,过夜培养16-20hr。晚上将将新鲜的菌落接种于2ml-5mlSOB培养基的试管中,37℃振荡培养过夜,转速控制在180rpm。
2)第二天,取过夜培养物250uL转接入含50ml SOB培养基(1:200)的500mL摇瓶中,37℃剧烈振荡 (300rpm)培养至OD600约为0.72-0.76,将细菌培养物置于冰水混合物中骤冷。
3)用两个预冷的50ml离心管于4℃ 2000g离心10分钟。收集菌体,弃上清。
4)用预冷的水(纯净双蒸水,高压蒸汽灭菌)轻轻重悬菌体,先加入少量水重悬菌体,然后把水加满,4℃ 2200g离心10分钟,弃上清。
5)再用10%甘油重复步骤4)两次,2400g离心10分钟,最后一次倒尽上清后,用残存管底的甘油悬浮细胞,分装ep管,100ul/支(一般,25ml起始培养物最终用200-250uL10%甘油悬浮)。
6)放入液N2中速冻,保存于-70℃。

注意
1) 菌种最好是-70℃冻存的,活化后生长状态较好。
2)2ml培养过夜,震荡速度不要过高(一般应该是37度,300rpm,6hr,当天转接,这样一天内工作量太大,这里我们选择过夜培养,时间长,转速控制在180rpm, 可以适当缩短时间,前一天晚接种,第二天早转接)
3) 培养完毕后一定要骤冷,使培养物在短时间内迅速冷却。冰水混合物中摇动瓶子,大约10分钟。
4)所使用得器皿一定要非常干净,没有化学物质残存,可以先用餐洗净洗,再加入NaOH固体和蒸馏水产热,最后用蒸馏水反复冲洗干净。注意pH值检测。
5)培养完毕后得离心操作一定要低温,所用的水和甘油,离心管都要冰上预冷。
6)整个过程尽量不要用枪吹打。
7)器皿和试剂最好最后用重蒸水涮洗和配制。
8)控制好菌体的OD600值,我用JM109操作时值为0.727和0.757时都获得非常高效的转化率。而0.83时转化率明显降低。根据季节不同JM109达到相应OD值
所需时间有所差异2.5hr-3hr45min。
9)最后一次务必倒尽上清后,用残存管底的甘油悬浮细胞,一般每管仅剩200uL左右。切务用过多甘油液悬浮细胞,我曾用350-500uL10%甘油/25mL出发菌液,导致细胞浓度下降,电转效率低2-3个数量级。

2.电转化protocol(方案由李芃同学提供,lzf继承)

1) 将电击杯冰上预冷 ,冻存的感受态细胞取出冰上融解
2) 30ul感受态细胞,加入1ul纯化的连接液(或者加入0.3-0.5uL未纯化的连接液),冰上放置60s-90s
3) 将混合液加入预冷的电击杯, 注意擦干杯外的水,防止电火花
4) 3kv,200欧姆,25uF(我们用的是BioRad电转化仪,0.2电转化杯),时间常数应该在4.5-5ms之间(其值越大,说明感受态细胞中离子去除越彻底。) 电击
5) 加入1ml 37度保温的SOC,将混和液洗出,此步有热击的作用,室温进行
6) 37度震荡培养1-1.5hr,可适当延长时间,使其充分表达抗性
7) 涂板

注意,
1) 电击之前保持低温状态。
2) 连接液要纯化,去除离子,ddH2O溶;或者加入0.3-0.5uL未纯化的连接液,切务过多以免电火花,我曾试过0.3uL和0.6uL连接液的加入细胞做对比,转化效率相当。
3) 原核生物受体细胞电击以15kv/cm 场强为最佳,电击电压根据电击杯厚度选择
4) 电击杯使用完,用针头蒸馏水反复冲洗杯底,再用70%乙醇浸泡,4度存放,使用前烘干即可。或者烘干后,-20度冰箱存放。
5)37度震荡培养时间切务过长,否则会有很多的卫星菌落和轻微的菌膜干扰。我曾培养1hr45min即出现上述卫星菌落和轻微的菌膜干扰。
作者:无城

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