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慢病毒的浓缩与纯化

来源:未知 作者:无城 人气: 发布时间:2011-11-08
摘要:方法一 超速离心沉淀法 1. 取6个Ultra-clear SW28离心管,用70%乙醇消毒后,放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。 2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。 3. 取一支10ml的移液管,吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。将移液管一

方法一 超速离心沉淀法

1. 取6个Ultra-clear SW28离心管,用70%乙醇消毒后,放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。

2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。

3. 取一支10ml的移液管,吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。将移液管一直插入到离心管的底部,缓慢将蔗糖溶液打出4 ml。同样地,将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管,对剩下3管进行同样处理。

4. 用PBS调整各管的重量,使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。

5. 按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。

6. 4℃,25,000 rpm. (82,700g) 离心2小时。

7. 小心将管子从转头中取出。倒掉上清,将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底应当有可见的沉淀。

8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀。

9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中,盖上盖子。

10. 在4℃溶解2小时,每隔20分钟轻轻震荡。

11. 4℃,500g离心1分钟,使溶液集中于管底。

12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。

13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份,保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。

方法二 PEG-8000浓缩法

1. 5X PEG8000+NaCl配制 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中;121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min;保存在4℃。

2. 使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液;

3. 每30ml过滤后的病毒初始液,加入5X PEG-8000+NaCl母液7.5 ml;

4. 每20~30min混合一次,共进行3-5次;

5. 4度放置过夜;

6. 4度,4000 g,离心 20min;

7. 吸弃上清,静置管子1~2分钟,吸走残余液体;

8. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀;

9. 集中后的病毒悬液分装成50 μl每份,保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80 ℃

作者:无城

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