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PCR反应体系计算器

来源:懒人在线计算器 作者:编辑 人气: 发布时间:2016-11-04
摘要:PCR反应计算器 (仅供参考) 从这个下拉菜单中选择一种酶 KOD Hotstart KOD NOT Hotstart Fermentas Taq与MgCl2 Invitrogen HiFi Bioline Taq Fermentas Taq与KCl和MgCl 2 组成 体积 反应 最终 10X缓冲区(包含 KCl和MgCl 2 已经) 5.00 50.00 mM dNTPs 1.00 10.
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PCR反应计算器(仅供参考)

Fermentas Taq与KCl和MgCl2

组成

体积

反应

最终

10X缓冲区(包含 KCl和MgCl2已经)

5.00

 

50.00

mM dNTPs

1.00

 

10.00

正向引物 ( µM)

1.00

 

10.00

反向引物 ( µM)

1.00

10.00

模板

 

10.00

Taq聚合酶

0.25

 

2.50

ddH2O

40.75

 

407.50

 

 

500.00

推荐循环参数:

初始变性为 1-3分. 在 95°C

变性 94-95°C 为 0.5 - 2 分
退火温度 55°C 为 0.5 - 2 分
扩展 72°C 为 1 分每kb.

 

 

 


PCR反应体系主要成分介绍

1.缓冲液 标准的缓冲液含 10mM Tris·HCl , pH 为 8.3-9.0(室温),而在延伸温度(72 ℃)下,pH 值接近 7.2 。缓冲液中含有一种二价阳离子,用于激活 DNA 聚合酶的活性中心,一般使用 Mg2+ ,有时使用 Mn2+ 。一般以 MgCl2 的形式提供,标准浓度为 1.5mM 。 Mg2+ 浓度的高低会影响扩增的特异性和产率。缓冲液中还含有 50mM 的钾离子。有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率,提高富含 G+C 模板的扩增效率。

2.脱氧核苷三磷酸(dNTP) 脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物,标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP ,即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP ,终浓度一般为 200mM(即饱和浓度)。 dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。

3.引物 在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1mM ,即 1pmol/ml , 在 100 μl 反应体系中相当于6x1013个分子。如果 5% 用于扩增 1kb 的 DNA 片段,可得到 3.3 μg 的产物,足以用于常规分析。
引物设计一般要考虑以下几个问题:
① 长度:至少 16bp ,通常为 18-30bp ,更短的引物一般会降低扩增的特异性,但会提高扩增的有效性。
② 引物的解链温度:两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5℃ 。对于小于 20 个碱基的引物其 Tm 值可用简易公式计算,即 Tm=4(G+C)+2(A+T)。 对于 14-70 个核苷酸的引物可用以下公式计算。 Tm=81.5+16.6(1g[K+])+0.41(G+C)%-(675/N) N 表示引物的核苷酸数目, [K+] 表示单价离子即钾离子的浓度。
③ 避免引物内部或引物之间存在互补序列(3个碱基),从而减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成。
④ G+C 含量:尽量控制在 40% 至 60% 之间, 4 种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列,以及 T 在 3" 末端的重复排列。
⑤ 引物的 3" 末端最好是 G 或 C ,但不要 GC 连排。

4.模板 模板的数量会直接影响扩增的效果。对于一般的 PCR 扩增,104至107个模板分子可达到满意的效果。用人类或哺乳动物基因组 DNA 进行扩增时,一般使用 1μg DNA , 相当于单拷贝基因有 3×105 个拷贝。以酵母菌、细菌、质粒和 M13 噬菌体噬菌斑的 DNA 作模板时,要达到这么多拷贝数分别需要 10ng,1ng,1pg 和 1% 噬菌斑。
作者:编辑

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