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蛋白质银染原理与方法

来源:未知 作者:admin 人气: 发布时间:2009-04-28
摘要:蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团(如琉基、碳基等)与银的结合,检测极限是 2~5.0ng/蛋白条带。

     原理:蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团(如琉基、碳基等)与银的结合,检测极限是 2~5.0ng/蛋白条带。                          

①                        
                                SDS-PAGE电泳。注意:银染检测蛋白质的水平是在100ng左右,与Commassie
                                Blue染色比较,银染加样量要少。否则难以得到清晰的电泳分辨率。
                                ②                        
                                电泳结束后,戴手套将PAGE胶转移到干净的玻璃培养皿或TIP头盒盖中。加入25ml Fixing
                                Solution(固定液),室温振荡保温30min。胶需要完全淹没在固定液中。
                                ③                         彻底弃去固定液,加入25ml 
                               

 Incubation
                                Solution(保育液),室温振荡保温30min。胶需要完全淹没在保育液中。
                                ④                         彻底弃去Incubation
                                Solution(保育液),用50ml去离子水洗3次,每次5min。
                                ⑤                         准备:取2.5ml 10X
                                Silvering Solution, 加入22.5mL水,混匀后使用。
                                ⑥                         弃去洗涤的水,加入25ml
                                Silvering Solution (银染液)。室温振荡保温20min。
                                ⑦                         彻底弃去银染液,加入25mL
                                Developing
                                Solution(显色液),室温振荡保温1~10min。注意观察目的条带。如果目的条带出现了,可以考虑终止显色。显色时间不要过长,否则本底较深。
                                ⑧                          彻底弃去显色液,
                                加入25mLStopping Solution(终止液),室温振荡保温10min。
                                ⑨                          彻底弃去Stopping
                                Solution(终止液),用50mL去离子水洗3次,每次5min。
                                 弃去洗涤的水,加入25mL Preserving
                                Solution(保护液),室温振荡保温20min。银染PAGE胶可以拍照保存,也可以室温玻璃纸干燥。

 

今天第一次银染,结果出来啥也没有,凝胶就像一块海带一样。能不能提供详细的银染步骤呢?好像有好几种版本,哪位大侠有经验的希望能点拨一下?

hotstoe wrote:
1. 取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.
2. 0.1% 硝酸银染色10分钟.
3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.
4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.
显色液配方: 10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.

这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.

我的经验是:1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次,
2.0.1% 硝酸银染色10分钟.
3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟(换2次去离子水)
4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来,要求越高可能导致背景就深,
5.染色后要用固定液(冰乙酸)终止染色,
6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍(整个试验比较费去离子水)。

多谢各位的指导!
我现在是在12%的凝胶里加入丙三醇优化.
现在的问题是背景和条带都很浅.仍能分辨读出条带数,但是拍摄出来的还是不清楚.
请问有必要提高硝酸银的浓度吗?(我现在用的是0.15%的硝酸银)

向各位请教几个关于TRAP-银染的问题,多谢各位指教。我用的是鼎国的试剂盒做的TRAP,用的是8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后是银染,但是结果很令人失望,电泳的胶取下来的时候竟然破成了好几片,染色后也看不出什么结果,我想问的是TRAP-银染,这个实验成功的关键步骤在哪里,哪一步最容易出问题?银染后理想的结果应该是什么样子的?请说的具体点好吗,谢谢。背景是什么样的比较好,还有条带应该是什么颜色,有多深,什么样的。谢谢了!

我的做法是这样的,染色效果还可以
10%的乙醇固定10分钟,ddH2O洗一次, 2分钟。
1%的硝酸脱色4分钟,ddH2O洗两次,每次1分钟。
0.2%AgNO3染色20分钟,ddH2O洗三次,每次1分钟。
NaCO3-甲醛显色至条带出现。
我的感觉是乙醇和硝酸重复使用的次数不要太多,这样效果不好,NaCO3-甲醛得质量很关键,我们有一次换了试剂,效果非常差。

1)  10%乙醇,5 min;
2)双蒸水过水2次(短暂);
3)1%硝酸,5min;
4)双蒸水过水;
5)0.2%硝酸银,在摇床摇动10 min;
6)双蒸水过水(不超过5sec);
7)显影液显影,边晃动边显影,至显影满意为止;
8)10%冰乙酸固定,至无气泡;
9)40℃烘箱,3天;
10)剥离,保存。

Notes:显影液的配制:
无水碳酸钠3.09g
甲醛 100ul
硫代硫酸钠(1%) 10ul
双蒸水 100ml

银染法分以下几个程序:
1、固定
2、敏化
3、银育
4、显影
5、停显
此外,其间还有数步的漂洗程序。
在你的银染方法中没有敏化过程,不过也中可以的,只是灵敏度会下降。
银染法还可分为碱性银染和酸性银染法,你的方法为酸性银染法。

为何称为酸法?是指硝酸银这一强酸弱碱盐溶液因水解呈酸性而得名?
何为二胺类银染法?俺知道有银铵法,即在硝酸银溶液中加入氢氧化钠,银离子在氢氧化钠的作用下生成氢氧化银沉淀,后加入过量氨水,形成可溶的银铵络和物,而后者经甲醛还原为单质银颗粒。二胺法可是指此络和物为二铵盐?您这里的“胺”应为“铵”。
至于敏化作用,众说纷纭,且银染的灵敏度相当高,对常规分子生物学实验已是牛刀小用,敏化俺认为还是不用的好,因为对背景不利。
对于银染的研究在80年代的electrophoresis杂志中多有报道。

小经验:为便于控制显影速度,得到最佳的信噪比,银染的显影液温度不要过高,以10度左右为宜,高则易显影过度,背景深,低则显影时间长。

考染后银染我做过不少次,银染的效果还是不错的。无需把考染的蛋白条带全部脱色,只要本底脱差不多就可以了。银染的固定步骤也可以省略,因为在考染前已经固定过了。只需要用6.25%乙酸钠+0.125%戊二醛+30%乙醇+0.25%硫代硫酸钠浸泡30min,去离子水清洗3次,每次5min,0.1%硝酸银染色20min,去离子水清洗膜两面,就可以用碳酸钠+甲醛的显色液显色了,直到自己满意为止,再用5%乙酸终止显色。效果还是很好的。

1,--原理: 蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团(如琉基、碳基等)与银的结合,检测极限是 2~5.0ng/蛋白条带。
2,材料及注意;
固定和脱色液
10%(/)戊二醛(用50%贮液现用现配,Kodak)
硝酸银溶液(含氨)
洗印显影液
Kodak快速定影液A
【注】全过程需穿戴手套,以免指纹污染。
3,步骤:
步骤:
l)将聚丙烯酰胺凝胶放在塑料容器并以5倍体积的固定液覆盖,在旋转摇床中缓慢摇
动 30min以上。
2)倾去固定液,加 5倍凝胶体积的脱色液,缓慢摇动 60 min以上。
3)倾去脱色液,加 5倍凝胶体积的 10%戊二醛,在道凤橱中缓慢摇动 30min。
小心:带手套并仅在通风泅中进行。
4)倾去戊二醛溶液,用水洗凝胶4次以上,每次 30 min以上,最后一次洗涤以过夜为
佳。缓慢摇动。
5)倾去水,将凝胶置于约5倍凝胶体积的硝酸银榕液中平衡(完全盖没凝胶),剧烈振荡
15 mln。
小心:由于氨银溶液干燥会发主爆炸.应马上用大量水冲洗
6)将凝胶移至另一塑料盒,用去离子水洗5次。每次精确5min,缓慢摇动。
7)用500mL水稀释25mL显影液,将凝胶移至另一塑料盒,加人足够的稀释显影液盖
没凝胶,并剧烈摇动至条带达到需要的强度。如果显影液变成傣色。须换新鲜的显影
液。
8)换Kodak快速定影液,定影5 mln,必要时,用湿润了的棉花搽去凝胶表面沉积的残
余银沉积物。倾去定影液,用水彻底冲洗凝胶(4~5 min)。
9)凝胶拍照

这是我经常用的步骤,经过检验n次了,希望能帮助你。
蛋白银染步骤
步骤 溶液 时间
固定 甲醇 100ml
冰醋酸 25ml
加双蒸水至250ml 30min
冲洗 双蒸水 3次
敏化 甲醇 75ml
戊二醛(25%w/) 1.25ml
硫代硫酸钠(5%w/) 10ml
醋酸钠(17g)
加双蒸水至250ml 30min
冲洗 双蒸水 3次
银反应 硝酸银溶液(2.5%w/) 25ml
甲醛(37%w/) 0.1ml
加双蒸水至250ml 20min
冲洗 双蒸水 2次
显色 碳酸钠(6.25g)
甲醛(37%w/) 0.05ml
加双蒸水至250ml
2-5min
终止 EDTA-Na22H2O(3.65g)
加双蒸水至250ml 10min
冲洗 双蒸水 3次

我室固定的蛋白银染方法,效果很不错,也很简单,步骤如下:
1)PAGE胶切下后用50%乙醇(100ml左右)洗三次,每次20分钟
2)2%硫代乙醇酸钠稀释50倍作用1分钟,双蒸水洗3次,每次20秒
3)2%硝酸银稀释10倍作用20分钟,双蒸水洗3次,每次20秒
4)6%碳酸钠溶液显色,直到条带清晰为止,一般几分钟,大量水冲洗
5)加中止液10%乙酸中止即可

silia wrote:
我室固定的蛋白银染方法,效果很不错,也很简单,步骤如下:
1)PAGE胶切下后用50%乙醇(100ml左右)洗三次,每次20分钟
2)2%硫代乙醇酸钠稀释50倍作用1分钟,双蒸水洗3次,每次20秒
3)2%硝酸银稀释10倍作用20分钟,双蒸水洗3次,每次20秒
4)6%碳酸钠溶液显色,直到条带清晰为止,一般几分钟,大量水冲洗
5)加中止液10%乙酸中止即可

大家好,我看了此贴,有一点不太明白,
硫代乙醇酸钠,是什么药品,是不是作者写错啦?望大虾指点。急,盼复。另外,其后的洗20秒还是20分呀?


我推荐使用graymatter 的protocol,基本上和我们用的一致,应该很稳定的,其中稍稍有一些经验,如:

1. 固定这步是可以过夜的。
2. 加银染液后一定要避光!!
3. 在固定、银染这几步最好放在摇动托盘上!这样随着的液体的晃动作用比较均匀。
4. 显色这步很关键,需要一些摸索,新手经常会显过了,整个gel黑糊糊的!
5. 显色对光线没有太大要求,室内可见光就行。
6. 接触gel时有条件一定要带一次性手套,要不然可以染出来一个大手印的!

前面几位说的很好,而且看来非常富有经验
不过,咱也贡献一把吧,只是一点注意事项:
1,最好全部用去离子水,电阻>=18兆欧
2,如果想要充分显色,可以适当提高温度,比如37度温箱
3,最好戴手套处理全过程

ptotocol是这样的,请看哪里不妥:
蛋白银染步骤
步骤 溶液 时间
固定 甲醇 100ml
冰醋酸 25ml
加双蒸水至250ml 30min
冲洗 双蒸水 3次
敏化 甲醇 75ml
戊二醛(25%w/) 1.25ml
硫代硫酸钠(5%w/) 10ml
醋酸钠(17g)
加双蒸水至250ml 30min
冲洗 双蒸水 3次
银反应 硝酸银溶液(2.5%w/) 25ml
甲醛(37%w/) 0.1ml
加双蒸水至250ml 20min
冲洗 双蒸水 2次
显色 碳酸钠(6.25g)
甲醛(37%w/) 0.05ml
加双蒸水至250ml
2-5min
终止 EDTA-Na22H2O(3.65g)
加双蒸水至250ml 10min
冲洗 双蒸水 3次

建议使用silia的方法!!
简单,快!
本人的银染方法:
1. 固定:100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml 0.04%HCHO, 20ml ddH2O,洗三次,每次>=20分钟;
2. 50%EtOH洗PAGE胶三次,每次20分钟;
3. 预处理:0.02% Na2S2O3 处理一分钟;
4. 水洗:ddH2O漂洗三次,每次20秒;
5. 染色:0.8ml 20%AgNO3+72ml 0.04%HCHO处理PAGE胶20分钟;
6. 水洗:同上;
7. 显色:25ml 12%Na2CO3, 24ml 0.04%HCHO, 1ml 0.02% Na2S2O3, 漂洗10-15分钟;
8. 水洗:同上;
9. 终止:50%MeOH, 12%H Ac,10分钟。
以上步骤从中科院生化所学来,过程和silia 的基本一致,不知道是否有出入,请大家指正。谢谢!!!

5.2.2.3 银染色
1 银染液1(1000ml) : 甲醇50% 乙酸12%
甲醇 500ml 冰醋酸 120ml
2 银染液2(1000ml): 甲醇30%,乙酸钠0.4M,戊二醛0.5%,硫代硫酸钠0.1%, (含乙酸 1-2ml)
甲醇300ml 乙酸钠54.4g 戊二醛10ml 硫代硫酸钠1g 乙酸1-2ml
3 显色液(1000ml) 无水碳酸钠2.5% 甲醛 0.02%
无水碳酸钠25g, 甲醛1.5ml
4 硝酸银(100ml): 20%硝酸银 (过滤后待用)

染色步骤:
1 银染液1 洗2次, 每次5分钟
2 银染液2 洗1次,每次30分钟
3 超纯水 洗2次, 每次1分钟
4 0.5%硝酸银 洗30分钟
5 超纯水洗5次,每次1分钟 (关键步骤,共计5分钟)显色液显色
6 看到各条带,则倾去显色液, 1% 乙酸中止


我感觉浸银后、显色前的水洗非常关键,时间不能太长,次数不能太多,否则可能会染不上颜色。但水洗不充分又可能导致背景较深。
我个人一般是用水洗三遍,每次半分钟左右。

固定液:50%乙醇,10%冰醋酸,40%水
浸泡液:30%乙醇,6.8% NaAc,50%戊二醛 0.625ml,0.2% NaS2O3•5H2O
银染液:0.1% AgNO3,0.02% 甲醛
显色液:2.5% Na2CO3,0.01% 甲醛
终止液:1.46% EDTA-2Na•2H2O

银染方法:参照phamacia 公司提供的银染方法。
凝胶-固定液30分钟-浸泡液30分中-水洗5分钟,2次--银染液20分钟---显色液2-10分钟--终止液10分钟。完毕!

像海带是什么意思,都染黑了吗,首选确定是不是有蛋白,如果这个没问题那就是染色时间过长了,注意银染几分钟条带就出来了,一定要看着它着色,一旦觉得是最佳效果,要立刻换终止液终止反应

上面是我以前查的别人以及自己的经验,你可以参照着总结一下,大致步骤都差不多的

谢谢DF1。蛋白现在还不能确定有没有。但是MARKER也没有看到。染色时间可能是太长了。我再试试。

作者:admin

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