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NF-kappaB信号通路研究

来源:基因时代 作者:无城 人气: 发布时间:2016-08-13
摘要:NF-kappaB是一个大家族,包括:RelA(p65)、c-Rel、RelB、NF-kappaB1 (p50/p105)、NF-kappaB2 (p52/p100)。其中以RelA(p65)研究最为深入。 通常所说的是左边的经典途径,大致意思是这样:非激活状态下,RelA(p65)与一种名为IkappaB的蛋白结合,停留在胞浆中,

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Active Repression of Antiapoptotic Gene Expression by RelA(p65) NF-kappa B(

 

NF-kappaB是一个大家族,包括:RelA(p65)、c-Rel、RelB、NF-kappaB1 (p50/p105)、NF-kappaB2 (p52/p100)。其中以RelA(p65)研究最为深入。
通常所说的是左边的经典途径,大致意思是这样:非激活状态下,RelA(p65)与一种名为IkappaB的蛋白结合,停留在胞浆中,不发挥转录活性。当炎症因子等刺激时,IkappaB的上游激酶IkappaB kinase(IKK)磷酸化而激活。IKK使IkappaB降解。p50有核定位信号,没有了IkappaB的束缚,p50会拽着RelA(p65)往核里面跑。RelA(p65)识别特定的DNA序列,并结合上去,从而调控靶基因的转录(这些基因的启动子上含有RelA(p65)的结合序列:5’-GGG(A/G)(C/A/T)T(C/T)-3’)。

一般来说,NF-kappaB的激活促进细胞生长,许多抗肿瘤药物以NF-kappaB为靶点,有兴趣的战友可以找些相关文献来看看。然而,某些情况下NF-kappaB的激活却有诱导凋亡的作用。

在读这篇文章以前,我一直认为NF-kappaB的激活包括这样三个过程:
(1)NF-kappaB入核。
这个过程可以用Western blot检测核蛋白中NF-kappaB的水平,或者免疫荧光看NF-kappaB的亚细胞定位。
(2)NF-kappaB结合到DNA上。
这个过程可以用EMSA或ChIP来检测NF-kappaB与DNA的结合能力。
(3)启动某个基因的转录。
这个过程可以用荧光素酶报告基因技术检测靶基因的转录水平。
 具体的实验原理和方法请大家自己去查,这里就不多说了

相信很多人都有跟我相同的观点,认为NF-kappaB对靶基因的调控一定是促进的,从入核到结合到DNA上,再到促进靶基因转录,顺理成章,所以在检测NF-kappaB的激活的时候,就在上述三个环节选一个做做了事。最近帮老板评毕业论文,很多做NF-kappaB的激活都只做了Western blot检测核蛋白中NF-kappaB的水平,或只做了荧光素酶。读了这篇文章以后,大家就会明白,仅仅做Western或荧光素酶是不够的。

对于NF-kappaB既有促生长又有促凋亡的作用,普遍的观点认为是NF-kappaB选择性地结合促生长基因或促凋亡基因启动子而导致的。然而在读了这篇文章后,我才知道原来NF-kappaB对靶基因的调控不仅是促进的,还可以是抑制的。而NF-kappaB既有促生长又有促凋亡的作用,不仅是由于NF-kappaB选择性地结合促生长基因或促凋亡基因启动子,还可以是对靶基因的选择性地激活或抑制。至于如何选择,关键在于刺激因素。

下面为大家讲讲这篇文章。

Introduction
大家熟悉的一些经典的NF-kappaB激活因子,如tumor necrosis factor α (TNFα) 、interleukin 1 (IL-1)、lipopolysaccharide (LPS) ,然而还存在一些非经典的激活因子,如UV-C和一些化疗药物。经典的激活因子激活NF-kappaB非常迅速,1h可达高峰,而非经典的激活因子激活NF-kappaB则相对较慢。已发现多种可被NF-kappaB上调的抗凋亡基因,如Bcl-xL、 X-IAP、IAP1、 IAP2、IEX-1L、Bfl-1。然而,NF-kappaB也具有促凋亡作用,机制尚不清楚,可能与上调某些促凋亡基因有关,如:Fas and Fas-ligand (FasL)。(这是传统的观念,如上文所说,对于NF-kappaB既有促生长又有促凋亡的作用,一直认为是NF-kappaB选择性地结合促生长基因或促凋亡基因启动子而导致的)
于是在本研究中,作者研究了非经典的激活因子引起的NF-kappaB激活,以及抗凋亡基因的调控作用。

实验结果
1、UV-C刺激可抑制NF-kappaB依赖的基因转录
作者在前期的研究中发现,以UV-C处理U-2 OS人骨肉瘤细胞系,并不会引起NF-kappaB转录活性的增加。这引起了作者的好奇,于是作者对这一现象的细节进行了研究。
EMSA显示UV-C处理后,NF-kappaB与DNA的结合能力显著增加,但速度较慢,4h达到高峰。如图1A所示。图1B则显示,入核的NF-kappaB复合体是RelA/p50的异源二聚体,与TNF诱导的入核的NF-kappaB复合体有相同的迁移率,TNF作为系统阳参。
 

图1C图1D,荧光素酶报告基因实验显示TNF刺激后,NF-kappaB的转录活性增高,这是预期的结果,作为系统阳参。然而,UV-C刺激后NF-kappaB的转录活性却明显下降。两个图的第三个图是用无NF-kappaB结合位点的报告基因质粒做的阴参,阴参的荧光素酶值没有下降。C与D的区别在于构建到荧光素酶报告基因中的启动子序列不同,C用的质粒的插入片段是三段NF-kappaB结合序列串联而成,D用的质粒是HIV-1的启动子序列(含有NF-kappaB结合序列)。(这个实验以及上面的两个实验是本文最关键的亮点,EMSA显示NF-kappaB与DNA的结合能力增强,而报告基因却显示NF-kappaB的转录活性下降,说明NF-kappaB不仅具有促进基因转录的能力,还有抑制基因转录的能力,颠覆传统观念

UV-C刺激可激活p53,而p53可抑制NF-kappaB的转录活性,U-2 OS是一株p53野生型细胞,于是NF-kappaB的转录活性下降有可能是p53导致的,为了排除这一假设,作者又选用了Saos2 和H1299这两株p53突变型的细胞株。图1E,这两株细胞的荧光素酶结果与U-2 OS的结果是一致的,NF-kappaB的转录活性都呈下降趋势,说明NF-kappaB的活性下降是不依赖于p53的,至少是不完全依赖于p53。

2、柔红霉素、阿霉素刺激也可抑制NF-kappaB的转录活性,但依托泊甙却没有这种作用
继UV-C之后,作者又使用了三种化疗药物,柔红霉素、阿霉素、Etoposide (依托泊甙、足叶乙苷、依托扑沙、鬼臼乙叉甙),三者均是拓扑异构酶Ⅱ抑制剂,都可导致DNA损伤。这一部分的实验套路与第一部分是差不多的。
图2A、B显示,柔红霉素处理后,NF-kappaB与DNA的结合能力增强,但相对于UV-C,高峰出现得更晚。NF-kappaB复合体也是RelA/p50的异源二聚体。

图2C显示,柔红霉素、阿霉素可下调NF-kappaB的转录活性,但依托泊甙却增强了NF-kappaB的转录活性。说明并非由于拓扑异构酶Ⅱ的抑制或DNA损伤导致了NF-kappaB的转录活性下调。

图2D显示,在p53突变的细胞株中同样存在这种现象,说明与p53无关,与UV-C是一致的。

为了证明该实验系统的可靠性,以及NF-kappaB的转录活性的下降是特异的,也就是说,要证明并不是UV-C和柔红霉素刺激后所有的转录因子的转录活性都会下降,需要用一个刺激后转录活性增强的转录因子做为系统阳参,于是作者选用了插入了p53下游基因p21和Bax启动子的荧光素酶报告基因质粒,检测了p53的转录活性。图2E显示,p53的转录活性是增加,这与UV-C和柔红霉素处理后p53上调是一致,说明并不是所有被UV-C和柔红霉素激活的转录因子都会抑制下游基因的转录,作者的实验系统是可靠的。

有研究显示,UV-C、柔红霉素、阿霉素可以以IKK依赖和非依赖的形式激活NF-kappaB,为了证实本研究中,NF-kappaB的激活是IKK依赖的还是非依赖。图2F的Western显示,UV-C、柔红霉素处理后,IkappaB降解,IKK磷酸化IkappaB位点的磷酸化水平增加。这一结果说明UV-C、柔红霉素刺激时,IKK是激活的。
这里我觉得作者其实还是没有证明UV-C、柔红霉素激活NF-kappaB是IKK依赖还是非依赖的,只是证明了UV-C、柔红霉素处理时,IKK是激活的。要证明是依赖性途径还是非依赖性途径,需要用IKK的特异性抑制剂或用dominant negative IKK来阻断IKK的激活,这样做的话会增加很多工作量,而激活NF-kappaB究竟是IKK依赖还是非依赖的,其实对本研究的核心内容来说并没有太大关系,也许是作者没有深入研究的原因吧。

3、UV-C、柔红霉素抑制NF-kappaB靶基因的表达
荧光素酶报告基因证实,UV-C、柔红霉素刺激后,NF-kappaB的转录活性是下降的,但荧光素酶报告基因毕竟不是内源性的NF-kappaB靶基因的启动子,NF-kappaB靶基因的表达究竟有没有被抑制,还需要检测NF-kappaB靶基因的mRNA和蛋白表达水平。
于是作者进一步研究了NF-kappaB的一些下游基因的表达,包括抗凋亡基因:Bcl-xL、X-IAP、A20,和促凋亡基因:Fas,以及IkappaBα。图3A的第一列和图3B,RT-PCR显示Bcl-xL、X-IAP、A20、Fas、IkappaBα的表达都是增加的。注意,这里各基因的表达高峰是不同的,A20和IkappaBα在A图的时间点中没有出现表达增加,所以作者把时间点缩短了,见图B,在更短的时间点里,可以检测到表达的增加。作者对不同基因表达高峰时间点的不同的解释是:需要不同的其他转录因子共同调控基因转录、共激活因子,以及启动子的染色质结构不同。
UV-C、柔红霉素则抑制了Bcl-xL、X-IAP、A20的表达,而Fas的表达却显著增加,说明UV-C、柔红霉素对NF-kappaB下游靶基因的抑制作用是有选择性的。另外作者还检测了SMAC和survivin,这两个不受NF-kappaB调控的凋亡基因,作为阴参,这两个基因的表达没有变化,说明UV-C、柔红霉素的作用是NF-kappaB特异性的。另外作者在p53突变型的细胞系H1299中检测了Bcl-xL和X-IAP,趋势和U-2 OS中是一致的,说明UV-C、柔红霉素的作用是p53非依赖性的。

作者进一步用Western检测了Bcl-xL和X-IAP的蛋白水平,也呈下降趋势。

作者进一步用插入Bcl-xL启动子的荧光素酶报告基因质粒,和相应的突变了NF-kappaB结合位点的报告基因质粒,检测了NF-kappaB的转录活性,结果显示UV-C、柔红霉素都可以以NF-kappaB依赖性的机制抑制Bcl-xL的转录。(结果是处理组与对照组荧光素酶值的比值再取对数,所以负表示相对于control转录活性下降,正表示相对于control转录活性增加)
如果把插入Bcl-xL启动子的荧光素酶报告基因质粒的NF-kappaB结合位点突变掉,那么Bcl-xL的转录水平会相对增加。

4、UV-C、柔红霉素、阿霉素抑制RelA反式激活结构域(Transactivation domain),不依赖于RelA第505位苏氨酸
这一部分可能比较难理解,其实说白了就是检测RelA的活性位点,不看这一部分也不会影响对全文的理解。作者构建了Gal-4和RelA的融合蛋白,Gal-4是酵母中的转录因子。再用含Gal-4结合位点的荧光素酶报告基因来检测RelA的反式激活结构域。
可能一些刚接触分子生物学的战友还不太清楚什么叫反式激活结构域(Transactivation domain),下面是从网上找到的两段解释。

反式激活结构域(Transactivation domain) 是反式作用因子的转录调控结构域,一般由DNA结合结构域外的30-100个aa组成.
常见的反式激活域有以下几种:①酸性α谨螺旋结构域(acidic a-Helix domain)如Jun;②富含谷氨酰胺结构域(glutamine—rich domain)如SPl.③富含脯氨酸的结构域(proline-rich domain)。
反式作用因子家族
同一类序列特异性转录因子一般由基因家族编码,它们的蛋白结构同源,并结合特异的顺式调控元件,这些蛋白组成一个反式作用因子家族。
1.POU家族
这一家族中都有一个独特的DNA结合结构域-POIJ结构域.POU结构域包括:
N端POU特异结构域(POUs)+C端POU同源异形结构域(POUH).POU结构域是Pit1,octl/oct2和unc86等反式作用因子共有的保守区,因此这类蛋白统称为POU结构域蛋白。
2、类固醇激素受体家族
包括:糖皮质激素受体(GR),性激素受体(ER/AR),甲状素激素受体 (TR),维甲酸受体(RAR),VitD3受体(VD3R).这些受体位于胞质或核内,通过激活基因转录起作用.这些受体的DNA结合结构域都含有2个Cys2/Cys2型锌指基序,(分别由2个外显子编码),可识别DNA上的激素应答元件(HRE:Hormone responsive elements)
3、NF-κB家族
包括RelA(P65),P60,RelB,C-Rel,P50五种.主要是P50/RelA异二聚体。胞质中P50/RelAIκ B抑制蛋白(失活状态)→释放Iκ B而被激活→易位至核内→激活转录。

顺式作用元件就是指可影响自身基因表达活性的DNA序列。在不同真核基因的顺式作用元件中会时常发现一些共有序列,如 TATA盒、CCAAT盒等。这些共有序列就是顺式作用元件的核心序列,它们是真核RNA聚合酶或特异转录因子的结合位点。顺式作用元件通常是非编码序列。顺式作用元件并非都位于转录起点上游(5′端)。根据顺式作用元件在基因中的位置、转录激活作用的性质及发挥作用的方式,可将真核基因的这些功能元件分为启动子、增强子及沉默子等。
真核调节蛋白又称转录因子。绝大多数真核转录调节因子由某一基因表达后,通过与特异的顺式作用元件相互作用(DNA-蛋白质相互作用)反式激活另一基因的转录,故称反式作用因子。有些基因产物可特异识别、结合自身基因的调节序列,调节自身基因的开启或关闭,这就是顺式作用。具有这种调节方式的调节蛋白称为顺式作用蛋白。


不同的刺激可能通过修饰RelA的不同的位点而发挥不同的调控作用,作者的前期工作发现肿瘤抑制因子ARF可通过抑制RelA第505位苏氨酸的磷酸化而发挥抑制RelA活性的作用,如果将RelA第505位苏氨酸突变为丙氨酸,那么ARF就失去对RelA活性的抑制作用。有兴趣的战友可以看看下面这篇文章,也是发表在Molecular Cell上的。于是作者这里也检测了UV-C、柔红霉素、阿霉素对RelA活性的抑制作用是否也是505位苏氨酸依赖的。但结果显示UV-C、柔红霉素、阿霉素对RelA活性的抑制作用与505位苏氨酸无关。见图4A

另外,作者前期工作发现,dominant-negative ATR的表达质粒可以阻断ARF对RelA活性的抑制作用。但dominant-negative ATR却无法阻断UV-C、柔红霉素、阿霉素对RelA活性的抑制作用。说明UV-C、柔红霉素、阿霉素对RelA的作用方式与ARF是不同的。(作者没给出实验数据)
图4B是作为系统阴参和阳参。阴参是Gal-4,阳参是Gal-4和p53的融合蛋白,前面也讲了,p53活性是增加的,所以荧光素酶值也是增高的。

5、UV-C、柔红霉素的抑制作用对于TNF的激活作用是显性的
这一部分研究内容并不复杂,但思路很重要,对于我们的科研思维很有启发,大家可以重点看看思路。
上文的实验结果显示,UV-C、柔红霉素、阿霉素可以增强NF-kappaB与DNA的结合能力,但却抑制了NF-kappaB的转录活性。这一现象有两种可能的解释:
1、NF-kappaB对转录的激活作用还需要其他共激活因子的辅助,UV-C、柔红霉素、阿霉素的刺激缺乏招募其他正向调控的共激活因子的信号。
2、UV-C、柔红霉素、阿霉素的刺激使NF-kappaB本身由转录激活因子转变为转录抑制因子,可能是通过招募其他转录抑制因子而形成转录抑制复合物。
那么如何来证明呢?作者用TNF来共处理,如果是第1种机制,那么TNF的刺激补充了其他共激活因子,因而NF-kappaB的转录活性应当增强。如果是第2种机制,那么即使用TNF的刺激,NF-kappaB的转录活性仍被抑制。
图5AB显示,TNF共处理,NF-kappaB的转录活性仍是被抑制的。

图5C显示,TNF共处理,NF-kappaB下游靶基因的转录也是被抑制的。

另外,作者用EMSA证明了,UV-C、柔红霉素不影响TNF与DNA的结合。(先用UV-C、柔红霉素预处理,再加TNF)

图5F显示,TNF可增强RelA第536位丝氨酸的磷酸化水平,而UV-C、柔红霉素不影响该位点的磷酸化,进一步提示UV-C、柔红霉素与TNF的不同作用机制。

图5G,ChIP检测RelA与靶基因启动子的结合能力,与EMSA的结果是一致的,p21作为系统阴参。

6、抑制Bcl-XL的表达依赖于RelA
上文证明了UV-C等刺激后的入核的RelA可以抑制靶基因的表达,但UV-C等刺激后靶基因表达水平的抑制是否完全依赖于RelA呢?所以作者用了RelA基因敲除的细胞和RelA的siRNA来进一步研究。
作者使用的细胞是野生型和RelA基因敲除的裸鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)。UV-C、柔红霉素处理后,野生型细胞中Bcl-XL的mRNA水平和蛋白水平都下调,而在RelA基因敲除细胞中,Bcl-XL的表达没有变化,说明UV-C、柔红霉素对Bcl-XL的抑制作用通过而且仅通过RelA。

下图是EMSA证明UV-C在RelA敲除细胞中不会增强RelA的DNA结合能力。

下图western显示,UV-C、柔红霉素并不会导致IkappaB的降解,IkappaB磷酸化在柔红霉素刺激后增强,UV-C刺激后无明显增强,说明柔红霉素刺激可能依赖于IKK,而UV-C刺激则不依赖于IKK(这个结果与图2F的结果不一致,图2F显示在U-2 OS细胞里IkappaB降解,IKK磷酸化IkappaB位点的磷酸化水平增加,说明不同细胞系之间存在一定的差异)。TNF作为阳参,可见IkappaB的降解和再合成,以及IkappaB磷酸化增强。

用p53、Mdm2、ARF同时敲除的细胞检测UV-C、柔红霉素刺激后Bcl-XL的mRNA水平,证明UV-C、柔红霉素对Bcl-XL表达的抑制作用不依赖于p53、Mdm2、ARF,进一步证实RelA作用的特异性,UV-C、柔红霉素对Bcl-XL表达的抑制作用依赖于RelA。

采用RelA基因敲除的裸鼠胚胎成纤维细胞毕竟不同于原先采用的细胞,所以作者用回U-2 OS人骨肉瘤细胞系,采用RelA的siRNA来研究。
下图显示,干扰可以逆转UV-C、柔红霉素对X-IAP表达的抑制作用。对Bcl-XL来说,由于干扰RelA即可抑制Bcl-XL表达,UV-C、柔红霉素刺激后干扰RelA与未干扰组虽然没有显著差异,但相对于未刺激的细胞来说,干扰RelA也逆转了UV-C、柔红霉素对Bcl-XL表达的抑制作用。
另外,Fas的表达未见明显改变,可能存在RelA非依赖的机制。

7、RelA基因敲除细胞抵抗UV-C杀伤作用的能力增强
由于UV-C通过RelA抑制抗凋亡基因表达,所以RelA敲除细胞抗凋亡基因表达水平相对较高,抗UV-C诱导的凋亡能力较强。而TNF通过RelA增加抗凋亡基因表达,所以RelA敲除细胞抗凋亡基因表达水平相对较低,抗TNF诱导凋亡能力较弱。
这一部分是功能研究。单纯研究信号通路可能没有什么实际意义,所以作者做了点功能研究,是为了说明,他发现的新机制能产生细胞功能的改变,对细胞生长产生影响。

8、UV-C、柔红霉素的作用与组蛋白去乙酰化酶有关
有研究发现,组蛋白去乙酰化酶HDAC1,2,3通过直接或间接作用于RelA而调控NF-kappaB的转录活性。具体的调控环节包括NF-kappaB与DNA的结合能力、NF-kappaB的核输出、以及RelA的转录活性。由于组蛋白去乙酰化酶有抑制基因转录的作用,因此UV-C、柔红霉素对靶基因的转录抑制作用可能与组蛋白去乙酰化酶有关。
作者用免疫共沉淀证实了UV-C、柔红霉素处理后RelA与组蛋白去乙酰化酶的结合增强。而TNF刺激后,RelA与组蛋白去乙酰化酶的结合并未增强。
过表达HDAC1可抑制NF-kappaB的转录活性。
采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可逆转UV-C、柔红霉素对Bcl-XL表达的抑制作用。且这种作用依赖于RalA。

ChIP证实UV-C、柔红霉素刺激可下调Bcl-XL、IkappaBα启动子的乙酰化水平

小结和感想
文章的内容很丰富,抓住各部分的大标题,理清思路,其实并不难理解。
首先是作者的前期研究中发现,某些刺激能激活NF-kappaB,但并不会引起NF-kappaB转录活性增强,所以作者在本文里详细地研究了这一现象。
作者通过EMSA和荧光素酶报告基因发现,某些刺激因素可以增强NF-kappaB与DNA的结合能力,但NF-kappaB却抑制了靶基因的激活,否定了NF-kappaB只能促进靶基因激活的传统观念。这是本文最大的亮点。
接下来的一些实验是进一步证明这一现象。这部分亮点不多,但有一点需要特别注意,NF-kappaB抑制抗凋亡基因的转录,却能同时促进促凋亡基因转录,说明NF-kappaB可以同时存在促进转录和抑制转录的作用,并不是某些情况下统统促进,或者统统抑制。
最后作者研究了为什么不同刺激能使NF-kappaB发挥促进或抑制的作用。这部分内容虽然不多,但观念很重要。转录因子结合特定序列往往不是独自行动的,而是带着一些其他调控因子形成一个复合物一起结合上去的,所以转录因子究竟发挥促进还是抑制作用,与其结合的其他调控因子有关。而究竟哪些调控因子会一起结合上去,则与刺激因素有关。
转录因子在何种情况下会结合哪些调控因子,又会发挥怎样的调控作用,这是极其复杂的问题,目前关于这个方面的研究还很不深入,也是信号转导研究的前沿方向,有兴趣的战友可以关注一下。
我觉得这篇文章给我们的最大的启发就是,做信号通路切切不可想当然。NF-kappaB与DNA的结合能力增强就一定会有靶基因的激活吗?不做从头仔细做一遍,根本不会想到NF-kappaB还可以抑制靶基因的转录。NF-kappaB抑制靶基因的转录就一定会统统抑制吗?不多选几个靶基因做一遍,也不会想到还可以选择性地发挥促进或抑制作用。NF-kappaB对靶基因的调控是选择性的结合加上选择性的促进/抑制,所以我们研究NF-kappaB时只做个western或者荧光素酶还够吗?别人的文献永远都只是参考文献,参考而已,不是真理,也不能等同于自己的发现。对于自己的研究一定要扎扎实实得走好每一步。


 

作者:无城

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