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基因打靶细胞系的制备及应用

来源:仁源 作者:编辑 人气: 发布时间:2017-03-12
摘要:近年来,基因编辑技术已经得到了迅速的发展。CRISPR- Cas9 作为第 3 代人工核酸内切酶系统,是一种具有广阔应用前景的基因定点修饰工具。利用的 CRISPR- Cas9 系统建立基因敲除的细胞系,具有时间短、难度低、费用少等优点,是广大科研工作者的好帮手。 1、

近年来,基因编辑技术已经得到了迅速的发展。CRISPR- Cas9 作为第 3 代人工核酸内切酶系统,是一种具有广阔应用前景的基因定点修饰工具。利用的 CRISPR- Cas9 系统建立基因敲除的细胞系,具有时间短、难度低、费用少等优点,是广大科研工作者的好帮手。

1、基因打靶细胞系制备的基本原理

基因打靶是指通过 DNA 定点操作,改变基因组中的特定基因的编码序列,从而在细胞或生物活体内研究基因的功能及干预。细胞系基因打靶最常见的是基因敲除,其原理是:基因组靶序列经 CRISPR-Cas9 切割后在缺乏修复模板的情况下,主要以非同源重组的方式进行修复,会在切割位点插入或删除一些碱基,引入移码突变,从而导致基因不能表达有功能活性的蛋白。

2、基因打靶细胞系的应用

基因打靶细胞系在基因功能研究、人类生理病理机制研究及新药研发中起着非常重要的作用。

(1)基因功能研究

相比于基因过表达和 Knock-down 的细胞系,基因打靶的细胞系往往表型更加显着,这样对于阐明基因的功能往往更有帮助。一些基因的敲除,甚至出现细胞致死的现象。碰到这样的问题,可以采用诱导性的基因打靶方案来解决。

了解基因的功能, 对于提高人类对自身疾病、衰老、进化、种族血缘等生命现象及其本质的认识, 疾病的诊断、预防和治疗,克服生存障碍,提高生存质量,都有非常重要的意义。

(2)药物筛选

近年来,随着基因编辑技术的日益兴盛,基因编辑的疾病动物模型在药物筛选中起到越来越重要的作用。例如通过基因打靶技术构建的高度免疫缺陷的 NSG、NCG 等小鼠,用于构建 PDX 模型。同时,基因编辑的细胞模型,在肿瘤、免疫、抗体筛选等领域,也有广泛的应用前景。

(3)细胞治疗

目前最热门的细胞治疗技术,如 CAR-T,PD-1 基因敲除 T 细胞等,都用到细胞基因打靶技术。Crispr-Cas9 系统的便捷性、通用性、以及可对多个目标进行基因编辑,在细胞治疗领域有极广的应用前景和可能。

3、基因打靶细胞系的制备方法

(1)基因打靶载体的构建;

(2)细胞转染与筛选;

(3)细胞的测序鉴定;

(4)单克隆的筛选与鉴定

1. SgRNA 的设计、合成与克隆

2. 细胞转染与筛选

3. 混合样品的测序鉴定

4、 仁源生物基因打靶细胞系的制备:技术成熟、可获得单克隆,最快只需 3 个月

仁源生物技术(上海)有限公司(Humangen Biotech Inc)是一家高科技生物医药技术企业。由多名留学美国的生物学与医学博士创建,拥有多项专利技术,在基因打靶领域具备丰富的经验。

在细胞基因打靶领域,仁源生物建立了基于 CRISPR/Cas9 技术的基因打靶平台,能够实现对特定细胞中的目标基因进行定点敲除、突变或敲入,可用于研究基因功能、信号传导、疾病机理以及药物开发,也可以实现对特定细胞的标记。

5、结果实例

在细胞基因敲除的下述案例中,分别获得了杂合子克隆和纯合子克隆:

6、服务提供

完全基因敲除的细胞系(完全基因敲除致死的细胞系提供杂合子),细胞数量不少于 1×106;提供细胞 PCR 鉴定条件及结果;提供细胞测序鉴定结果;提供包含实验过程和中间结果的详细技术报告。

7、服务周期

3-6 个月

仁源生物技术(上海)有限公司

作者:编辑

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