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封闭剂在细胞免疫荧光中的应用

来源:未知 作者:编辑 人气: 发布时间:2016-09-30
摘要:I、步骤: 一、固定: PBS5min3次 振荡洗涤制作好的细胞爬片。 固定液覆盖细胞,RT 静置15min。 PBS 5min3次 振荡洗涤。 二、通透化: 通透液覆盖细胞,RT 静置30min。 PBS 5min3次 振荡洗涤。 三、封闭: 封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。 四、一抗孵育: 一

I、步骤:

一、固定:

PBS 5min×3次 振荡洗涤制作好的细胞爬片。

固定液覆盖细胞,RT 静置15min。

PBS 5min×3次 振荡洗涤。

二、通透化:

通透液覆盖细胞,RT 静置30min。

PBS 5min×3次 振荡洗涤。

三、封闭:

封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。

四、一抗孵育:

一抗以合适浓度稀释PBS,覆盖标本表面。

4℃孵育过夜,第二天37℃复温1h。

PBS 5min×3次 振荡洗涤。

五、二抗孵育:

fitC标记二抗以合适浓度稀释于PBS,覆盖标本表面。

37℃避光孵育<60min。

PBS 5min×3次 避光 振荡洗涤。

六、染核:

新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面,RT避光静置<10min。

PBS 5min×3次 避光 振荡洗涤。

七、封片:

在干净的载玻片上滴一滴封片剂,将爬片的细胞面扣在封片剂上。

八、镜检,4℃避光保存。

II、注:

1、细胞密度要合适,状态较好。

2、从孵育二抗开始要避光(关闭室内日光灯即可)。

3、完成后最好及时镜检,照相;分别用不同波长激发荧光,在Photoshop软件下合成一张图。

III、试剂配制:

1、固定液:4%多聚甲醛/PBS:

4g多聚甲醛,50~80mlPBS,加热至60℃,持续搅拌至完全溶解,(通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮),定容100ml,RT保存。

2、通透液:0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS

3、封闭液:正常山羊血清稀释于PBS;或商品化封闭液成品。

4、Hoechst:Hoechst33258即可。

5、封片剂:50%(v/v)甘油/PBS。

作者:编辑

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