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重组羧肽酶B的性质与抗体碱性峰检测

来源:雅心生物 作者:编辑 人气: 发布时间:2016-09-19
摘要:羧肽酶 B (EC 3.4.17.2) 专一用于蛋白质 C-末端碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)的水解;又称为肽酰-L-赖氨酸(L-精氨酸)水解酶;精蛋白酶。分子量为 35kD,等电点为 6.0,最适 pH 为 7-9。羧肽酶 B 是抗体碱性峰检测的特异酶,通过比较酶切前和酶切后
羧肽酶 B (EC 3.4.17.2) 专一用于蛋白质 C-末端碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)的水解;又称为肽酰-L-赖氨酸(L-精氨酸)水解酶;精蛋白酶。分子量为 35kD,等电点为 6.0,最适 pH 为 7-9。羧肽酶 B 是抗体碱性峰检测的特异酶,通过比较酶切前和酶切后的图谱来计算抗体碱性变体的比例,对于抗体的发酵工艺和纯化工艺稳定性的控制都具有重要的意义。
 
而在抗体碱性峰的检测中,没有完全统一的标准,如酶解缓冲液酶的用量,酶解时的温度和时间等。而这些与酶的性质密切相关。
 
可以选择的羧肽酶 B 有两种,一种是动物胰腺提取的羧肽酶 B,一种是基因工程的重组羧肽酶 B,前者由于胰腺中含有各种蛋白酶,如胰蛋白酶、糜蛋白酶等,常常不能彻底去除,在酶切时会有非特异的酶切杂峰出现,影响结果判断。后者为基因工程生产的,成分单一,无杂酶,比活高,应用上更有优势。
 
羧肽酶 B 的结构
 
天然存在的羧肽酶 B 是由前羧肽酶原 B(preprocarboxypeptidase B,preproCPB)经酶解产生,后者 N-末端包含 108 个氨基酸(其中 13 个氨基酸为信号肽序列,95 个氨基酸组成前导肽部分)的多肽片段与 CPB 相连。前羧肽酶原 B 在转运到内质网的过程中,信号肽被切掉,得到无酶活性的羧肽酶原 B(procarboxypeptiedase B, proCPB)并从细胞中分泌出来,最终在小肠中经胰蛋白酶在 Arg-95 处酶解,成为具蛋白酶活性的 CPB。proCPB 的分子量为 46kD,由 401 个氨基酸组成;CPB 分子量为 35kD,由 306 个氨基酸组成(如图 1)。在CPB 中,前体的活化主要依赖胰蛋白酶在 Arg95 位的切割,半球形前导肽被切割后,它既不会抑制酶体,也不再与之结合,这使得酶体能迅速发挥功能,并对前导肽 C-端的 Arg 进行切割。

 
图 1 羧肽酶原 B 的三维结构及其激活部位示意图
 
(上面暗红色部分代表前肽,下面蓝色部分代表羧肽酶 B,箭头所指为胰蛋白酶酶切激活位点)羧肽酶 B 的性质取重组羧肽酶 B 冻干粉,纯度见图 2。研究了重组羧肽酶 B 的最适 pH,最适温度,pH 稳定性及温度稳定性,对于 CPB 的使用起到指导作用。同时做了溶液的反复冻融稳定性,对于 CPB 酶液的储存和使用起到指导作用。

 
图 2 纯化后重组羧肽酶 B 的电泳分析
 
1、羧肽酶 B 的 pH 稳定性
 
将纯的重组羧肽酶 B 用纯水溶解为 10 mg/ml,之后用以下缓冲液稀释使酶液的终浓度为 1 mg/mL,pH 分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0、12.0, 25℃ 孵育 12 h 后测活。结果见图 3(左)。
 
2、羧肽酶 B 的最适 pH
 
测定 rCPB 纯酶液浓度为 1 mg/mL, 在不同 pH 条件下的催化速率,底物浓度为 0.1 mM/L,pH 分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、7.65、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0、12.0,pH3.0-5.0 用 50 mMNaAc-HAc 缓冲液配制,pH6.0-7.0 用 50 mMKPB 磷酸盐缓冲液配制,pH7.5-8.5 用 50 mM Tris-HCl 缓冲液配制,pH9.0-12.0用 50 mM Gly-NaOH 缓冲液配制。结果见图 3(右)。
 
图 3 rCPB 酶液的 pH 稳定性(左)和最适反应 pH(右)CPB 在 pH7.0-9.0 缓冲液中稳定,25℃ 孵育 12 h 无活性损失;最适 pH 表明,在 pH7.6 活性最大,在 pH7.5-pH8.5 活性均可以。在 pH≤7 和 pH≥10 时,基本无活性。
 
3、羧肽酶 B 的温度稳定性
 
将 rCPB 酶液配成浓度为 1 mg/mL,置于 4℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃ 条件下,每个温度三个平行,时间定为 15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、20 h 分别取样测定其活性,以初始时酶活定为 100%,以残余酶活百分比表示测定结果。
 
4、羧肽酶 B 的最适催化温度
 
在不同温度下恒温水浴测活底物,使底物的温度分别为 4℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃,取适量 rCPB 纯酶液,测定活力。以 254nm 吸光值 OD254 为纵坐标,时间为横坐标,结果表示见图 4(右)。
 
 
图 4 rCPB 酶液的温度稳定性(左)和最适催化温度(右)CPB 在 40℃ 以下保温 10 h,均活性稳定。最适催化温度显示,在 3 min 内,40℃以下均可保持良好的线性,其中,以 25℃ 为最佳。
 
5、羧肽酶 B 酶液的反复冻融稳定性
 
将 rCPB 酶液反复冻融,测定每次冻融后的酶活,计算活力保留率,得到同一管 rCPB 反复冻融 10 次后的活力稳定性(如图 5)。
 
图 5 rCPB 酶液的反复冻融稳定性
 
结果表明重组羧肽酶 B 反复冻融稳定性好。经过 10 次的反复冻融,几无活性损失。
 
抗体碱性峰检测
 
羧肽酶 B 的准备:用 1X PBS pH7.5, 溶解羧肽酶 B 至 1 g/L,分装后-20℃ 保存。
作者:编辑

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