欢迎来访Www.Ggene.Cn,基因时代为生命科学提供源动力!

网站地图帮助中心

二级
导航

蛋白质Western Blot 低成本快速半干转印方法

来源:威泰克 作者:编辑 人气: 发布时间:2016-09-19
摘要:随着半干转印系统不断进步,有越来越多的方法被应用于加速转印过程。例如,用户可以通过更换转印缓冲液、使用不同的转印装置,或调整转印条件、修改实验设计,从而缩短实验时间。这些方法对需要快速得到结果并做出正确判断的用户非常有用,比如从事临床检验
随着半干转印系统不断进步,有越来越多的方法被应用于加速转印过程。例如,用户可以通过更换转印缓冲液、使用不同的转印装置,或调整转印条件、修改实验设计,从而缩短实验时间。这些方法对需要快速得到结果并做出正确判断的用户非常有用,比如从事临床检验工作的用户。使用传统半干转印方法过去通常需要40〜60分钟完成一次转印,而现在通过使用快速缓冲液,Yrdimes®半干转印系统可以在7分钟之内完成蛋白质高效快速转印。Yrdimes®半干转印系统可以通过较少的转移缓冲液实现快速和有效的转印,特别是在缩短筛选大量样品所耗时间方面,Yrdimes®半干转印系统可在40〜60分钟内同时运行最多12块7×10cm的丙烯酰胺凝胶。此外,Yrdimes®半干转印系统中配备镀铂钛阳极板和不锈钢阴极板,可实现高度均匀电场,使转印效果更均匀,机器使用寿命更长。
 
    转印缓冲液为两电极间的化学环境提供电学连续性,从而在保持蛋白质溶解度的同时,不对蛋白质与固相转印膜的结合产生阻碍。转印缓冲液的成分会影响转印时间,使用通常传统实验用缓冲液在Yrdimes半干转印系统中,需要约40分钟转印样品,现在,使用Pierce®快速半干转印缓冲液,实验证明通过Yrdimes半干转印系统只需在7〜10分钟内即可完成快速转印。
 
材料
 
• 膜:0.45μm孔径的PVDF膜(PolyScreen®转印膜,PerkinElmer™)
• Yrdimes®半干转印系统(Wealtec)
• V-GES垂直电泳系统(Wealtec)
• ProMarker Plus(Wealtec)和293T细胞裂解液。
• 考马斯亮蓝染色: 0.5 g CCB/1000 ml MetOH: H2O: AOAC = 45:45:10.
• 脱色溶液:MetOH:H2O:AOAC = 45:45:10。
• PVDF膜脱色溶液:MetOH:AOAC = 90:10。
• Pierce®快速半干转移缓冲液,10X。(Thermo Scientific)
• Elite200电源(Wealtec)
• Dolphin-Doc 和 Dolphin-Chemi 的凝胶成像分析系统(Wealtec)
• 抗鼠β-肌动蛋白IgG抗体(Santa Cruz 生物科技公司)
• 山羊抗鼠IgG-HRP抗体(Santa Cruz 生物科技公司)
• 化学发光试剂(Western LightningTM)
 
方法

• 用Wealtec V-GES灌胶模具制备12%的SDS-PAGE
• 在SDS-PAGE胶中使用ProMarker Plus或293T细胞裂解液作为样本,用Elite 200电泳仪供电进行垂直电泳分离。浓缩胶80V/20分钟,分离胶120V/80分钟。
• 在此期间,用1:10比例的去离子水稀释10× Pierce®快速半干转移缓冲液,并在使用前搅拌均匀。
• 在稀释过的Pierce®快速半干转印缓冲液中平衡四张转印纸(〜1.25 mm)和两张超厚滤纸(约2.5 mm)10〜15分钟,轻轻振荡摇匀。
• 用甲醇预润湿PVDF膜1分钟,蒸馏水数分钟,并在稀释后的Pierce®快速半干转印缓冲液中平衡10〜15分钟。
• 电泳完成后,在超纯水中平衡SDS-PAGE10〜15分钟,轻轻振荡摇匀。
• 将SDS-PAGE放入稀释后的Pierce®快速半干转印缓冲液中,轻轻混合振荡10〜15分钟使平衡。
• 在Yrdimes转印槽的阳极板上将转印膜与凝胶的夹层组装起来,确保消除凝胶-膜各层之间的气泡。
 
                                             
• 合上Yrdimes的上盖向下按压弹簧锁,闭合上盖。
• 用恒压25 V转印7〜10分钟。
• 在此之后,按照如下步骤染色:
(a)考马斯亮蓝染色:
(ⅰ)使用考马斯亮蓝染色溶液给SDS-PAGE电泳和PVDF膜着色30分钟。
(ii)分别采用各自去色溶液去除着色
(iii)使用Dolphin-DOC凝胶成像分析系统拍照保存。
(b)化学发光反应:
(ⅰ)用TBST缓冲液洗涤PVDF膜10〜30分钟。
(ⅱ)将PVDF转到带有抗小鼠β肌动蛋白IgG抗体(1:1000)的TBST缓冲液1小时。
(ⅲ)使用TBST缓冲剂对PVDF膜清洗10分钟,重复三次。
(ⅳ)使用山羊抗 - 小鼠IgG-HRP抗体将PVDF转至TBST缓冲剂中按照(1:3000)的比例浸泡1小时。
(ⅴ)使用TBST缓冲剂对PVDF膜清洗10分钟,重复三次。
(vi)使用ECL化学发光试剂进行染色。
(vii)使用Dolphin-Chemi mini成像系统进行拍摄。曝光1分钟并进行10次叠加。
 
 
图1. ProMarker Plus在不同条件下的转印效率。使用5V(A)(B)与25V(C)(D)恒电压用Yrdimes转印7分钟,25V转印10分钟(E) (F)。左侧是SDS-PAGE胶,右侧是转印后的PVDF膜。
 
图2. 从SDS-PAGE胶向PVDF膜以25V电压转印7分钟后,在系列稀释的293T细胞裂解液中检测到β-actin。图中数字代表加载的293T细胞裂解液中的总蛋白含量。
 

讨论

    在结果中,在Yrdimes半干转印槽中使用Pierce快速半干转印缓冲液,被证明使用25V恒电压条件下7分钟可以达到非常好的转印效果 (图一),转印 后,膜上的蛋白质也可以通过免疫学步骤用ECL化学发光染剂染色(图二)。对比图1中使用的不同恒定电压之间转印效果,我们发现使用Yrdimes®半干转印系统电压恒压25 V(同时也是转印缓冲液推荐电压)将得到最好的转印效果。通过使用不同长度时间,可以看出只需要7分钟即可完成很好的转印效果。10分钟转印后,将有高达90%的蛋白质被转移到PVDF膜上。虽然转印效果会随着时间延长而提升,我们并不推荐转印超过10分钟。因为转移超过十分钟后,转移效率并不会有显著增加,不仅如此,该过程还会产生更多的热量并且增加了对凝胶和样品的损害可能,这是因为对Yrdimes®半干转印系统施加了25伏特的超高恒定电压的缘故。 如图2所示,该系列稀释样品的强度会随着样品数量的降低而减小。 这也证明了Yrdimes®半干转印系统可以很均匀地传输当与Pierce®快速半干式转移缓冲液一起使用时,该缓冲液对筛选大量样品非常有帮助。这篇文章证明了Yrdimes®半干转印系统可以在Pierce®快速半干式转移缓冲液辅助下,将蛋白质从SDS-PAGE电泳高速高效转印到PVDF膜上。实验结果表明Wealtec Yrdimes®半干转印系统不仅为用户提供了一个更快捷的蛋白样本转印方案,更展示了该系统的操作灵活性、易用性。
 
 
REFERENCES

• Kurien, B.T., Scofield, R.H., 2003. Protein blotting: a review. J. Immunol. Methods.
274: 1-15.
• Kurien, B.T., Scofield, R.H., 2006. Western blotting. Methods. 38: 283-293.
• Protein blotting application guide from Millipore Company.
• Pierce® Fast Semi-Dry Transfer Buffer instructions, Thermo Scientific.


视频演示如下
http://ggene.cn/html/video/shiyan/2016/0919/7737.html
作者:编辑

最火资讯

Copyright 2008-2015 Powered By Ggene.Cn.
鄂ICP备15005758号-1

声明:本网站尊重并保护知识产权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果我们转载或引用的作品侵犯了您的权利,请通知我们,我们会及时删除!