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直接检测细胞中磷酸化蛋白含量

来源:生物通 作者:无城 人气: 发布时间:2010-10-21
摘要:磷酸化和去磷酸化是细胞中酶的化学修饰调节中最常见,也是最重要的。很多酶需要磷酸化后才有活性,然后再进一步使它的下游磷酸化。Cisbio Bioassays 提供一系列HTRF磷酸化蛋白测量试剂,可以直接检测细胞裂解液或完整细胞中的磷酸化蛋白的含量。该方法操作简

 

磷酸化和去磷酸化是细胞中酶的化学修饰调节中最常见,也是最重要的。很多酶需要磷酸化后才有活性,然后再进一步使它的下游磷酸化。Cisbio Bioassays 提供一系列HTRF磷酸化蛋白测量试剂,可以直接检测细胞裂解液或完整细胞中的磷酸化蛋白的含量。该方法操作简单、稳定可靠、灵敏度高,并且可以用很小体积的微孔板进行实验,非常适合高通量筛选。

检测原理
实验可在细胞裂解液或者完整细胞中进行。当受体被刺激后,引发了相关激酶的活化,导致下游蛋白被磷酸化。细胞膜裂解之后,磷酸化的蛋白释放出来,被HTRF试剂检测到。磷酸化蛋白的测量应用了双抗体夹心法,两个抗体均为单克隆抗体。其中一个为抗磷酸化蛋白的抗体,标记Eu;另一个为抗蛋白其它位点的抗体,标记d2,见图1。这些抗体可以预先混合后,通过一次加样来完成。所有的实验均可通过两步法或者一步法实现。

 

 

图1:HTRF磷酸化蛋白测量的实验过程

一步法:
细胞铺板,化合物刺激,细胞裂解和磷酸化蛋白检测均在同一个板孔中,不需要洗涤过程(图2a)。此方法更加适用于高通量筛选,并且在不影响HTRF优越性的前提下减少了试剂用量。

两步法:
细胞置于培养板中,化合物刺激后裂解细胞。将裂解液转移到检测板中,加入HTRF检测试剂检测磷酸化蛋白(图2b)。该方法可以观察细胞的存活和生长情况。


特点和优势

  • 应用HTRF技术,稳定、灵敏、可靠
  • 基于一抗的直接检测方法
  • 直接检测细胞裂解液,操作简单快速,可替代Western Blot和ELISA
  • 可用于细胞水平的高通量筛选,并且相比其它技术拥有更高的Z’值
  • 适用于多种类型的细胞,包括原代细胞
  • 适用于过表达和内源性受体

实验结果
磷酸化Akt (Ser473)检测
铺满的大鼠 Fao细胞去除血清3 小时之后,用不同浓度的胰岛素刺激10分钟。磷酸化的AKT(Ser 473)含量通过HTRF 磷酸化Akt试剂盒检测,结果见图3。

图2a:一步法操作步骤

图2b :两步法操作步骤

图3:胰岛素刺激Fao细胞后AKT(Ser 473)的磷酸化水平

磷酸化ERK1/2的检测
铺满的 CHO细胞用不同浓度的吗啡刺激10分钟,通过HTRF磷酸化ERK测量试剂盒检测磷酸化的ERK含量,结果见图4。

图4:吗啡刺激阿片受体3后ERK1/2的磷酸化水平

产品信息
目前已经上市的HTRF磷酸化蛋白检测试剂盒,列表如下:

Cellul'erk---胞外调节蛋白激酶磷酸化测量试剂盒
    ---直接测量细胞水平实验中磷酸化ERK1/2的含量

ERK1/2是许多信号传导通路的会聚点
1)GPCR通过G蛋白调节一系列细胞内功能,这些信号最后都可会聚到ERK1/2上(图1)。GPCR受到刺激后,可通过下列途径使ERK磷酸化:

通过激活效应分子,如腺苷酸环化酶和磷脂酶C来影响细胞内第二信使的浓度,如cAMP, 二酰甘油, 肌醇1,4,5-三磷酸和钙离子等,第二信使传递信号到细胞内,引起ERK磷酸化

介导Gαi/o, Gαs, Gαq/11和 Gα12/13 依赖的MAPK级联信号的活化,包括ERK级联信号的活化

G蛋白的α和βγ亚基可通过受体酪氨酸激酶的反式激活作用来刺激ERK

GPCR还可以G蛋白非依赖性途径来介导ERK1/2的活化,该途径是β–Arrestin依赖性的

图1:ERK磷酸化途径

2)通过受体酪氨酸激酶磷酸化ERK
以表面生长因子受体(EGFR)为例。EGF和EGFR结合后,激活受体胞内的酪氨酸激酶活性,使EGFR被磷酸化。GRB2-SOS复合物与磷酸化的EGFR结合,SOS被活化。活化的SOS进一步活化小G蛋白Ras,活化Ras-Raf-MAPK通路,ERK被磷酸化。

检测原理
受体受到刺激,ERK1/2被磷酸化。在细胞膜裂解之后,磷酸化的ERK1/2释放出来,通过基于HTRF技术的双抗体夹心法被检测到。其中一个抗体是抗磷酸化ERK1/2的抗体,标记d2,另一个抗体是抗ERK1/2蛋白的抗体,标记Eu,如图2所示。这些抗体可以预先混合后通过一次加样来完成。该方法直接检测细胞裂解液中的磷酸化ERK1/2的含量。

试剂盒应用HTRF技术,不需要洗涤,比Western Blot、 ELISA和其它基于微珠测试的方法更加简单快速。实验步骤可以是一步法或者两步法。

图2:磷酸化ERK1/2的检测原理

应用领域
 Gi、Gs、Gq 蛋白偶联受体的活化
 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的感应器
 β–Arrestin 信号通路的研究
 受体酪氨酸激酶(RTK)的活化

实验结果
Gαq/i偶联的受体活化
如图3所示,Rantes 和 MIP-Ib在室温条件下刺激CCR5受体(CHO,25,000细胞/孔),时间为10分钟,用HTRF Cellul’ERK试剂盒来测试磷酸化ERK1/2水平。EC50分别为2.8 nM和18.8 nM,与文献报道一致。

图3:CHO-CCR5中ERK1/2的磷酸化水平

筛选的稳定性
用Carbachol (卡巴胆碱)在室温刺激CHO-M1细胞,时间为10分钟(5,000细胞/孔,384浅孔板),结果如图4。

图4:用Cellul’erk进行筛选具有很好的稳定性

选择未刺激的细胞、1.3 μM Carbochol和4 μM Carbochol计算Z’值,分别对应实验的基础水平、EC80和EC100,每种条件50个重复,实验采用一步法。两个条件的Z’值均大于0.7,表明实验非常稳定,可用于高通量筛选。

MAPK信号通路的活化
用PMA刺激CHO-M1细胞(50,000细胞/孔),时间为10分钟,结果如图5。

图5:PMA刺激的CHO-M1细胞中ERK1/2的磷酸化水平

PMA是PKC的直接激活剂。该实验得到的EC50为9.6 nM,检测窗口为4.5。

订购信息

联系方式
周时勇 Shiyong.Zhou@iba-group.com
孙翠巍
Cuiwei.Sun@iba-group.com
谢 兵
BXie@cisbio.us

作者:无城

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