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电子显微镜检测法检测细胞凋亡

来源:网络 作者:编辑 人气: 发布时间:2016-08-28
摘要:具有凋亡特征的细胞程序性死亡后,可在扫描或透射电镜下观察到凋亡小体,该小体系由细胞膜卷曲、脱落形成的小泡,其内包含有完整的细胞器及核片段。这种小体易被巨噬细胞、上皮细胞等吞噬,借以清除正常发育过程中死亡的细胞。细胞坏死则无此小体形成。但是

具有凋亡特征的细胞程序性死亡后,可在扫描或透射电镜下观察到“凋亡小体”,该小体系由细胞膜卷曲、脱落形成的小泡,其内包含有完整的细胞器及核片段。这种小体易被巨噬细胞、上皮细胞等吞噬,借以清除正常发育过程中死亡的细胞。细胞坏死则无此小体形成。但是并非所有发生程序性死亡的细胞皆形成凋亡小体。

一、仪器与试剂

射电子显微镜或扫描电子显微镜,组织切片机,离心机,离心涂片机。

戊二醛固定液:取25%戊二醛原液10ml,加入0.2mol/L PBS液50ml,再加入蒸馏水40ml,混匀,4℃保存。

锇酸固定液:将含有1g锇酸的小瓶浸入清洁液过夜,用双蒸水冲洗数遍后,将小瓶放在盛有50ml双蒸水的100ml棕色磨口瓶内,击破锇酸小瓶使其内锇酸溶于水,1~5ml小瓶分装,避光,4℃保存。用时再稀释1倍成1%的应用液。

二、操作步骤

离心收集约5×106 细胞,用PBS洗涤两次后,弃上清,加1ml 2.5%戊二醛悬浮细胞,移入1.5ml Ep管中,室温下4 000r/min离心15min,固定细胞0.5~1h;

在磷酸缓冲液里漂洗1~2h或更长时间,尽量将戊二醛冼净,用1%的锇酸固定液固定30min~1h;

固定完毕后加入50%乙醇脱水10min→70%乙醇10min→90%乙醇10min→90%丙酮10min→100%丙酮三次各10min;

丙酮与环氧树脂1:1包埋2h,再放入纯包埋剂(环氧树脂包埋全浸透)数小时或过夜;

环氧树脂包埋,62℃烤箱二天,进行超薄切片,用醋酸铅铀双染法进行切片染色;

在透射电子显微镜下观察细胞形态、细胞质及细胞核的变化,照相并记录实验结果;

三、结果判断

电子显微镜是观察细胞形态最好的方法,细胞核和细胞器的结构清晰易辨。凋亡细胞染色质固缩并凝结成块,聚集在核膜周边呈新月状或环状小体,细胞浆浓缩,内质网变疏松并与胞膜融合,形成一个个空泡,线粒体结构无明显改变。细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。坏死细胞的染色质稀疏呈细颗粒状,分布无规律,边界不清,细胞浆肿胀,细胞器结构破坏,细胞膜不完整。

作者:编辑

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