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MTT 的操作方法(三)

来源:丁香园 作者:编辑 人气: 发布时间:2016-08-22
摘要:五、MTT 法实验步骤 1. 胰酶消化对数期细胞,终止后离心收集,制成细胞悬液,细胞计数调整其浓度至 5~1010 4 /ml。 细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。 对于初学者而言,要使细胞达到 5~1010 4 /ml 往往不知从何处着手,我在这里向大家提供
五、MTT 法实验步骤

1. 胰酶消化对数期细胞,终止后离心收集,制成细胞悬液,细胞计数调整其浓度至 5~10×104/ml。
细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。

对于初学者而言,要使细胞达到 5~10×104/ml 往往不知从何处着手,我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。
以一般细胞培养常用的 25 cm2 为例,

1) 细胞密度在长到约 80%~90%(下图所示为 80%~90% 密度时细胞的大致状态),消化离心收集后,将上清去掉,加入 3 ml 培养基使其混匀。



2) 另取一支新的 15 ml 无菌离心管(为下一步接种 96 孔板用),装入约 9 ml 培养基.

3) 从第一步准备的 3 ml 细胞悬液中取 1 ml, 加入上管,混匀后细胞计数,此时一般为或小于 5-10×104/ml,该浓度相当于细胞计数板 4 个大格内每大格平均 5-10 个细胞(见下图);如果不够该浓度,再根据计数的结果滴加细胞悬液,每滴按 50ul 计算。

4) 细胞数量因实验目的不同应做相应调整,如一般细胞增殖实验每孔 2000 个就可以(相当于细胞悬液密度为 2×104/ml),细胞毒性实验每孔 5000~10000 个(相当于细胞悬液密度为 5×104/ml)。此外,还应根据细胞本身特性,如生长快慢,来决定细胞数量。比如:生长较快的细胞密度可略小。

2.将细胞悬液制备好后,轻轻混匀,每孔加入 100ul, 这样待测细胞的密度为 5000~10000/孔(边缘孔用无菌 PBS 填充)。
注意:因细胞在混匀后仍要继续沉降,因此接种的过程中要反复多次混匀,如每加 6 个孔就混匀一次,以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同,这对于 MTT 的结果至关重要。

3. 将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养,至细胞单层铺满孔底(96 孔平底板), 加入浓度梯度的药物, 原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药. 一般 5-7 个梯度, 每孔 100ul, 设 3-5 个复孔. 建议设 6 个,否则难以反应真实情况。下图可做为 96 孔板的的参考步局。
对于加药,有人直接将药物按不同体积加入到 96 孔板中,以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在 EP 管中将不同浓度的药物配好,然后将 96 孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)再加入 100ul 含不同浓度药物的培养基,这样能保证药物浓度的准确。另外,需注意的是,如果用这种方法,不要把 96 孔板的培养液全部吸走后再加药,应该吸完一部分后立即加样,避免由于 96 孔板干燥引起细胞死亡。

4. 5%CO2,37℃ 孵育 16-48 小时,倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。



5. 每孔加入 10ulMTT 溶液(5 mg/ml,即 0.5%MTT),继续培养 4 h。若药物与 MTT 能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用 PBS 冲 2-3 遍后,再加入含 MTT 的培养液。

6. 终止培养,准备溶解结晶。

溶解结晶的方法有两种,第一种,用 DMSO 溶解

1)MTT 加入培养 4 h 后,结晶可充分形成。将上清去掉,该过程要注意不能把 Formazan 结晶移走。有人直接用移液器将上清移走,也有人建议先铺几张滤纸在桌面,然后将 96 孔板轻轻倒置,这样上清便被滤纸吸走,以减少结果的损失。个人认为,这两种方法都有可能导致结晶的损失,从而引起结果的不准确。采用哪种方法,可以自己摸索一下再决定。
作者:编辑

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