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检测细胞凋亡的实验方法比较

来源:未知 作者:无城 人气: 发布时间:2009-10-11
摘要:◆ TUNEL 与 ELISA 检测凋亡的方法比较 TUNEL法 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-

◆ TUNEL 与 ELISA 检测凋亡的方法比较
TUNEL法
  细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3'-OH形成,很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.

ELISA法测细胞凋亡
细胞凋亡时,Ca2+,Mg2+离子依赖的内源性核酸内切酶将双链DNA从各核小体间连接区裂断,产生单或寡合苷酸小体,各核小体的DNA与核组蛋白H2A,H2B,H3,H4形成紧密的复合物而对内源性核酸酶有抵抗使之不被内源性核酸酶裂解。主要使用单克隆抗DNA抗体和抗组蛋白抗体直接检测DNA和组蛋白。

◆ 几种检测凋亡的方法
一、形态学观察方法
1、HE染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。
2、丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
3、台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。
4、透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
二、DNA凝胶电泳
(一)、检测原理
细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180-200bpDNA片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。
(二)结果判断
正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。
三、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定
凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA法检测。
(一)检测步骤
1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体;
2、在微定量板上吸附组蛋白体’
3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘
4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’
4、加酶的底物,测光吸收制。
(二)用途
该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器,适合基层工作,但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。
四、流式细胞仪定量分析
(一)检测原理
细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。
(二)应用价值
流式细胞仪检测具有以下特点:
1)、检测的细胞数量螅?虼似浞从橙禾逑赴?牡蛲鲎刺?冉献既?BR>2)、可以做许多相关性分析
3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析,可确定凋亡的细胞所处的细胞周期
■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法
细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性液增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
利用Hoechs-PI染色法,正常细胞对染料有抗拒性,荧光染色很浅,凋亡细胞主要摄取Hoecha染料,呈现强蓝色荧光,而坏死细胞主要摄取碘化丙啶(PI)而呈强的红色荧光。
■DNA片断原位标记法
凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞(或组织)结构保持不变的情况下,用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphate,DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3·的羟基(-OH)端结合,经显色反应后检测DNA裂解点的技术。
DNA片段原位标记法有二种:
1、原位缺口转移(in situ nick-translation,ISNT)技术,它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3·-OH端
2、原位缺口末端标记技术(in situ end labelling technique,ISEL),即TUNEL法,它是利用TdT将标记的DUPT接到3·-OH端。研究证明,TUNEL法的敏感性远高于ISNT,尤其对早期凋亡的检测,TUNEL更为合适。
■检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法
1、原理:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V(Annexin V)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,它于PS具有高度的结合力。因此,Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V,将Annexin V标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC),同时结合使用PI拒染法(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测,且对PI高染)进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。
2、结果判断:正常活细胞Annexin V 、PI均低染;凋亡细胞Annexin V高染、PI低染;坏死细胞Annexin V/PI均高染。
3、应用价值:细胞发生凋亡时,膜上的PS外露早于DNA断裂发生,因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin V联合PI染色不需固定细胞,可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此,Annexin V联合PI法更加省时,结果更为可靠,是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。

◆ 几点参考
1.大部分凋亡细胞可能并不见得有非常典型的凋亡表型,如电镜的染色体边集、凋亡小体等,DNA电泳也不见得都有DNA ladder,但对某些指标来说还算稳定,如PI染色及TUNEL法,所以如果某个方法效果不好,可以换用其他方法检测
2.坏死与凋亡的区分传统上认为是无序与有序的过程,楼上所说的线粒体肿大也是以前的一个传统认识,但现在有很多人认为坏死的发生也是有序发生的,因此也有了程序化坏死一说,在很大程度上,由于凋亡是时间依赖性的过程,细胞发生凋亡也并非同步化的,凋亡的晚期与坏死进行区分是困难的,而且我认为如果不是对于凋亡或是坏死本身通路进行研究的话,强行区分是没有意义的

◆细胞凋亡检测技术与方法
细胞凋亡(Apoptosis),又称细胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death),是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束其生命的过程。它是一个主动的,高度有序的,基因控制的,一系列酶参与的过程。细胞凋亡概念提出至今还不到30年的时间,但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色,对个体的正常发育及细胞凋亡紊乱在病理学研究中的重要作用,引起了人们对其机制和组分的广泛而深入地研究,成为目前生命科学界最为热门话题之一,也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域。从近年的SCI排名中我们可以看到,信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组方面的,而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究。随着这方面研究的持续升温,涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测,其中不少已经有商品化的产品出现,大大加速了研究的进程。具体来说,针对凋亡的不同阶段有以下一些方法(概括如图1):
1. 早期检测:
1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测:
PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生, 可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV,一个钙依赖性的磷脂结合蛋白,能专一性的结合暴露在膜外侧的PS,再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测(悬浮细胞和贴壁细胞都适用),可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。
美国著名生物试剂公司CLONTECH和INTERGEN公司分别开发了多种标记的Annexin V产品,简便快速,10分钟就可完成检测。其中带荧光标记的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC,灵敏度高,可作为FACS(流式细胞分选)方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白Annexin V-EGFP,EGFP与PS 的结合比例为1:1,还可进行定量检测。除此之外,还提供生物素偶联的Annexin V,可通过常用的酶联显色反应来检测。另外,MACS公司将磁珠包被Annexin V,可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。

2)细胞内氧化还原状态改变的检测:
这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势,研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通过荧光染料monochlorobimane(MC 体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化。
正常状态下,谷光苷肽(glutathione:GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要,许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。在Jurcat和一些其它类型的细胞中,细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时,细胞液就由还原环境转为氧化环境,这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低,从而使细胞色素C(三羧酸循环中的重要组分)从线粒体内转移到细胞液中,启动凋亡效应器caspase的级联反应。
由于 GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关,此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外,还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究。但有些细胞如:HeLa 和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH水平的变化,不能用此法检测。

3)细胞色素C的定位检测
细胞色素C作为一种信号物质,在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下,它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中,凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液,结合Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)后启动caspase级联反应:细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9,后者再激活caspase-3和其它下游caspase。
细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit Ⅳ:COX4)是定位在线粒体内膜上的膜蛋白,凋亡发生时,它保留在线粒体内,因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。
ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超离心,可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分,再进一步通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置,从而判断凋亡的发生。

作者:无城

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