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DMSO细胞冻存保护剂

来源:未知 作者:编辑 人气: 发布时间:2016-09-30
摘要:二甲基亚砜是一种重要的渗透型细胞保护剂。在深低温(零下200度)保存细胞时冻存过程中,为防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤,有必要使用含有DMSO冷冻保护剂。DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中,降低冰点、延缓冻存过程,同时提高

二甲基亚砜是一种重要的渗透型细胞保护剂。在深低温(零下200度)保存细胞时冻存过程中,为防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤,有必要使用含有DMSO冷冻保护剂。DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中,降低冰点、延缓冻存过程,同时提高细胞内离子浓度,减少细胞内冰晶的形成,从而减少细胞损伤。

深低温时二甲基亚砜的细胞毒性受到抑制。复苏时动作要快,尽快洗掉二甲基亚砜,否则会造成对细胞严重的毒性。二甲基亚砜(DMSO)是目前最好的细胞冻存保护剂,但也是一种以细胞毒性很大的化学试验剂。研究结果表明,培养液中DMSO浓度为10%时,细胞生长抑制率近100%;1‰浓度时抑制率为35%,即使是0.04‰的浓度,DMSO对细胞的生长也有不利的影响。

培养细胞时为防止以下问题,细胞将做冷冻保存:第一、株化细胞产生性状转变(transformation)。第二、污染。第三、株化细胞之增殖或生理特性有特定之限制,只能在一定的代数范围内进行增殖培养或进行特定实验。目前可能解决这些困难的方法其中之一是细胞冷冻保存法,将冷冻细胞储于冷冻管中,将其中一部分拿出来做一些必要的检查,其它的冷冻细胞则在需要时拿出来解冻,用来进行实验。本方法亦可节省继代培养时所花费的劳力、物力,并可防止培养中经常发生意外事故,丧失细胞珠。因此冷冻保存法为细胞培养研究上之基本技术之一。

[说明] :

1.经过冷冻保存后的细胞,其生存率会下降,冷冻时之冷却速度,保存温度,解冻时升高温度的速度以及添加之冷冻保存液之种类、浓度等都可影响细胞存活率。

2. 一般而言,4℃以下慢慢地冷冻,保存于液态氮中(-196℃)。

3. 37℃快速解冻。

4.保护剂(抗冻剂):添加甘油 (glycerol) ( I0 %左右 ) 或dimethy1sulfoxide (DMSO) ( 5- 10% ) 。

5.有些细胞如果采用上述的方法时,无法得到高的存活率。此时,则必需考虑可能伤害细胞的机制,添加剂之作用等而来找出适当的条件来修正。

[材料] :

1.增殖期之细胞 (9成满),培养于培养皿中数个。

2.冷冻用培养基(2倍) : 培养基内加入三倍血清及15% DMSO,保存在冰箱中。

3. 冷冻管、保利龙制容器、铝制ample支持棒。

[步骤]:

1.准备2 x 107cells/ml的细胞悬浮液。

2.冷冻用培养基(2倍) :以微温水溶解DMSO,在培养基中混合为15% (v/v)。这是DMSO的二倍浓度之溶液。必须在进行实验前在行配制,配好后放在冰箱中,使用量必须和细胞悬浮液的量相等;使用时维持在4℃。

3.分装: 在冷冻管管中分别加0.5ml (1/2冷冻管体积)冷冻用培养基(2倍)及2 x 10(7次方)cells/ml的细胞悬浮液;等量混合。将盖子扭紧后,在管中部贴上胶带密封。

4.记载卷标 : 用抗冻marker pen在冷冻管上写明细胞名称、代数、冷冻的年,月,日等所需要的项目。

5.放进冷却的保利龙容器中,而在- 80℃的超低温槽中放置一个晚上。

6.放进液态氮容器中及保存 : 在支持棒上装上冷冻管,迅速地放进容器内。

作者:编辑

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