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人源包皮角质形成细胞提取及培养过程的总结及问题

来源:丁香园 作者:编辑 人气: 发布时间:2016-08-22
摘要:说明: 组织来源:包皮手术中取下来的包皮组织。 遇到的问题: 1、细胞培养到10天左右时总会出现染菌。 2、细胞培养到10天左右会感觉本身就长没了。 第一次提取,步骤如下: 一、实验准备 1、表皮-真皮分离液 :Dispase,用 D-Hanks液配制,浓度为1.2U/ml(

说明:

组织来源:包皮手术中取下来的包皮组织。

遇到的问题:

1、细胞培养到10天左右时总会出现染菌。

2、细胞培养到10天左右会感觉本身就长没了。

第一次提取,步骤如下:

一、实验准备

1、表皮-真皮分离液 :Dispase,用 D-Hanks液配制,浓度为1.2U/ml(冷消化),0.22μm 滤器过滤,4℃保存。

2、表皮细胞分离液:0.25%胰酶/0.02%EDTA(1/1)。

3、培养基:Gibco的Defined K-SFM(将1ml生长添加物加入到500ml基础培养基中);

4、含有3X抗生素的PBS(不含钙离子、镁离子);

5、手术器械(眼科剪、眼科镊、手术刀片、200目筛网)高温高压灭菌;

二、实验步骤

1、为保证无菌,处理前将组织在75%乙醇中浸泡1min;

2、将组织转入培养皿中,用加入抗生素的PBS清洗,用眼科剪和眼科镊修剪,尽量去除皮下组织,并用手术刀片将组织分切为2mm×10mm小块;

3、取4块组织放入15ml离心管中,加入4ml表皮-真皮分离液,4℃消化过夜;

4、将消化后的皮肤倒入培养皿中,用眼科镊(一直一弯)将表皮和真皮仔细分离;

5、将分离的表皮放入离心管中,加入4ml表皮细胞分离液,37℃,消化15min;用含血清的DMEM培养基终止消化,用枪头反复吹打以获得单细胞悬液,过200目筛网以去除剩余残渣,收集滤液,离心去除消化液后用Defined K-SFM重悬接种到100mm培养皿中。

三、实验结果

1、刚分离(10x)

 

 

2、培养3天后第一次换液(即接种后第5天,10x)

 

 

可以很明显看到有不少贴壁的细胞,但红圈中的小亮点细胞也是贴在壁上的,冲洗不下来。

此后每隔2-3天换液一次。

3、接种后第8天(10x)

 

 

从显微镜下观察到细胞有明显增殖,但细胞表面紧紧贴着一层细胞一样,红色圈中所示。

培养到第10天左右时细胞基本上就没再长了,并且开始变得越来越少,像自己慢慢消失一样。

第二次提取

第二次提取同第一次提取不同之处为:

1、组织刚取回来后,将其浸泡在含有20μg/ml庆大霉素的DPBS溶液中(不含Ca、Mg)中1小时。

2、表皮和真皮分离的Dispase酶中也含有5μg/ml的庆大霉素。消化为冷消化,4℃-18h。

3、使用2ml 0.05% Trypsin-EDTA来分离表皮细胞,37℃消化约15min,每隔2-3min吹打一次。加10ml 终止液终止消化。

4、培养瓶用基质胶或多聚赖氨酸处理。

作者:编辑

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