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培养小鼠树突状细胞攻略

来源:未知 作者:admin 人气: 发布时间:2009-06-02
摘要:1. C57Bl/6小鼠 2. 处死小鼠,75%酒精浸泡10min 3.解剖取出小鼠股骨和胫骨 4.取出骨上组织 5.冲洗骨髓腔,直至骨变白 6.收集的细胞沉淀一10000/ml接种,培养液含200U/mlrmGM-CSF和IL-4 隔天换液并补充细胞因子,到第三天的时候如图:可以见到出芽状的突起,

1. C57Bl/6小鼠
2. 处死小鼠,75%酒精浸泡10min
3.解剖取出小鼠股骨和胫骨
4.取出骨上组织
5.冲洗骨髓腔,直至骨变白
6.收集的细胞沉淀一10000/ml接种,培养液含200U/mlrmGM-CSF和IL-4

隔天换液并补充细胞因子,到第三天的时候如图:可以见到出芽状的突起,突起还不是特别多,也不是很长
 

第8天的时候,细胞形态已经出来,如图所示:

细胞形态具有典型的树突状细胞形态,长长的突起,到这个时候细胞已经比较成熟了,补充一下:第七天半量换液的时候,加入TNF-a刺激细胞成熟
我是根据1999年lutz的方法,当然做了一些改进,培养DC很多人用的是高浓度的细胞,高浓度的因子,但是这样产量不高,我每一次分离一只小鼠的骨髓,大约可以得到10E+7个细胞,分成10盘,每盘10ml培养基,用低浓度的细胞因子,这样可以大大提高产量,每次能培养得到1*10E+7个DC左右,流式细胞术检测:细胞纯度应该大于90%,这个方法还是很好用的。

只能再加一个

Q&A:

1. DC 细胞一般用来做什么样的实验,能转染吗?

DC是专职抗原递呈细胞,能在体内外激活淋巴细胞,可以用于表位鉴定等等,能用于转染,我们就做了转染的。(瞬时转染)
2. 200U/mlrmGM-CSF和IL-4 —— 是指两种因子分别是 200U/ml ?
是的,两种因子的终浓度都是200U/ml

3. 第七天半量换液的时候,加入TNF-a刺激细胞成熟 —— TNF 浓度是多少,为什么
加 TNF ?
TNF-α一方面抑制粒细胞的产生,另一方面促进DC的成熟,使其具有很强的刺激T淋巴细胞的活性。因为我做的是要DC体外激活淋巴细胞所以加了TNF,TNF-a我加的终浓度是1000U/ml,刺激18小时候就收集细胞

您瞬转树突状细胞用的是什么转染试剂啊,转染效率如何?
不好意思,因为前期的实验不是我做的,所以不太了解,我们是用包装好的病毒,直接感染DC这样做的,是腺病毒载体,方法如下:
1. 将培养成功的DC以5×106/孔接种到6孔Costar细胞培养板中;
2. 每孔加入MOI为200的(Ad-目的基因),37℃、5% CO2饱合湿度下以最小体积的培养液转染4小时。对照组采用相同MOI的Ad-LacZ腺病毒;
3. 添加新鲜培养液,继续培养48小时后收获DC;
4. 免疫组织化学检测hTERT的表达。
基因修饰DC疫苗中目的蛋白的表达鉴定,采用免疫组化方法,主要操作方法如下:
(1) 将感染染Ad-hTERT的DC滴加到多聚赖氨酸包被的玻片上,室温静置20 min后,用PBS洗2次;
(2) 4%多聚甲醛室温下固定10 min,用PBS冲洗3次;
(3) 0.5% Triton-X 100室温作用15 min,用PBS冲洗3次;
(4) 3%H2O2-甲醛室温作用10 min,用PBS冲洗3次;
(5) 10%正常山羊血清封闭,湿盒室温孵育30 min;
Devil. 加1:50兔抗人hTERT一抗工作液,4℃孵育过夜后,用PBS冲洗3次;
(7) 加入生物素化羊抗兔二抗工作液,37℃湿盒温育20 min,用PBS冲洗3次;
Musical Note 加入辣根过氧化物酶标记的卵白素工作液,37℃湿盒温育20 min,用PBS冲洗3次;
(9) DAB显色3-5 min,终止反应;
(10) 梯度酒精脱水后烘干,二甲苯透明,中性树胶封片。
以感染Ad-LacZ的DC及未感染病毒DC为对照,观察hTERT在正常DC中的表达,PBS代替一抗为阴性对照。
还进一步采用WB方法检测了DC中目的基因的表达。

我做的是大鼠树突状细胞,用的也是全骨髓培养,但自己感觉细胞纯度不高,贴壁的细胞不少,那您换液时只收集漂浮细胞,贴壁的细胞怎么处理啊?

贴壁细胞我们都是丢弃了,贴壁的大多是成纤维细胞或者是巨噬细胞,原代培养细胞不纯是很正常的
不知道U和ng之间是如何换算的呢,因为我用的是R&D的细胞因子,是以ng为单位的,是否像论坛上有战友所说的1U=1ng呢?

答:活性单位是个效应单位,是表示生物制品的活性的,和质量单位不是简单换算关系。
有生物活性的物质,往往可杀死生物(如抗生素可杀死细菌)或促进生物增殖作用(多数细胞因子可促进细胞增殖)。在活性检测时,设定一个浓度剃度,测得最小致死量(如:抗生素)或最大有效量也称饱和有效量(如:某些细胞因子)的浓度,然后取中位数(即半数致死量或半数有效量)的倒数就是活性单位。如:R&D的说明书注明GM-CSF的Activity(活性):ED50 =10 - 60 pg/mL(ED50,ED是最大有效量,50表示50%,ED50就是半数最大有效量)。你取其倒数,就可算出它的活性单位了,因此,它活性远超1U/ng。
生物制品的活性不是固定不变的,不同的公司、不同的批次,其活性都不同,其中R&D的细胞因子活性是比较好的,也是比较稳定的。
我公司自主研发的rmGM-CSF的活性也相当不错,可和R&D的媲美,远好于peprotech的rmGM-CSF,而且价格只有R&D的1/4,因此,得到国内众多研究机构的喜爱。 
 

作者:admin

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